新しい原理に基づく電子移動型バイオセンサの基盤研究

基于新原理的电子传递生物传感器基础研究

• 批准号: 05J01937
• 负责人: 藤枝 伸宇
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J01937/
• 关键词: ヒスタミン脱水素酵素; アミン脱水素酵素; ヒスタミンセンサ; 分子内電子移動; 基質認識機構

現在までに我々は電子移動型バイオセンサの基本原理について研究を行ってきた。安全かつ信頼性の高い食品・水質管理および在宅医療などにおけるバイオセンサの役割は非常に大きい。そこでアミン脱水素酵素を例として取り挙げ、高感度・高選択的なバイオセンサ作製を視野にいれた研究を行っている。昨年度、酵素機能、特に基質認識・電子伝達機構を追及し、それに基づいたより戦略的な酵素の改変を行ってきた。具体的にはG268D/D269C、Y180F、G268D/D269C/Y180F変異体を作製し酵素活性評価を行った。また、野生株由来のヒスタミン脱水素酵素についてはその酸化還元コファクタとのひとつである6-S-CysteinylFMNの酸化還元挙動を新規な分光電気化学法である無隔膜バルク電解法により評価した。本年度はそれらの研究をより押し進め、もう一つの酸化還元コファクタである鉄硫黄クラスターの酸化還元電位をITO電極を用いて詳細に検討した。その結果、pH7付近においてはFMNとほぼ変わらない値を示し、pH>9においては急激に値が変化し負にシフトすることがわかった。これらのことより、鉄硫黄クラスターはあまり電子移動に関与していないことが示唆される。これはヒスタミン脱水素酵素に非常に類似した酵素であるトリメチルアミン脱水素酵素において提唱されている鉄硫黄クラスターの役割とまったく異なる結果となった。また、G268D/D269C/Y180F変異体についても同様に電気化学的解析を行なったところ、ほぼ野生株由来の酵素と同じ電位vs.pHプロファイルを示した。これらのことより、基質阻害には分子内の電子移動はほとんど関与しておらず、FMN近傍に阻害サイトが存在することが示唆された。一方で、オスミウム錯体ポリビニルポリマーを用いてヒスタミン脱水素酵素を電極に固定化することで感応膜を作製し、ヒスタミンセンサを作製した。酸化還元電位が酸化還元コファクタの電位と非常に近いオスミウム錯体を用いて、動作電位を下げることに成功し、0.1Vvs.SHEにおいてμMオーダーでシグナルが観測された。また、動作電位を下げることでアスコルビン酸などの電極活性物質の影響を最小限にできることがわかった。

Now, we are studying the basic principles of electronic mobile devices. Safety, reliability, food and water quality management, and home health care. For example, the enzyme is highly sensitive and selective, and the enzyme is used for field research. In the past year, enzyme function, special substrate recognition, electronic detection mechanism, and other basic elements of the enzyme change Specific enzyme activity evaluation for G268D/D269C, Y180F, G268D/D269C/Y180F variants A new method for the acidification of 6-S-Cysteinyl FMN was developed by photoelectrochemical method. This year, the research on the acidification of ITO electrode was carried out in detail. Results: pH7 is close to FMN, pH>9 is close to FMN. This is the first time I've ever seen an electronic device. The enzyme is very similar to that of iron and sulfur. G268D/D269C/Y180F is a new type of enzyme. It can be used to analyze the enzyme of wild plants. The electron movement in the molecule is related to the matrix, and the electron movement in the vicinity of the FMN is related to the matrix. A method for preparing a membrane by immobilizing a dehydro enzyme on an electrode is described. Acidizing reduction potential: Acidizing reduction potential: Very close to the center of the action potential: Action potential: 0.1 V vs. SHE: μM. The effect of acid on the electrode active material is minimal.

项目成果

Production of Completely Flavinylated Histamine Dehydrogenase, Unique Covalently Bound Flavin and Iron-sulfur Cluster Containing Enzyme of Nocardioides simplex in Escherichia coli, and its Properties

单纯诺卡氏菌完全黄素化组胺脱氢酶、独特共价结合黄素和铁硫簇酶在大肠杆菌中的生产及其性质

• 发表时间: 2005
• 期刊: Biosci. Biotech. Biochem. 69(12)
• 作者: Okuyama;S.;Lam;N.V.;Hatakeyama;T.;Terashima;T.;Yokogoshi;H.;Nobutaka Fujieda
• 通讯作者: Nobutaka Fujieda

Redox behavior of histamine dehydrogenase by separator-less one-compartment bulk electrolysis

无隔板一室本体电解对组胺脱氢酶的氧化还原行为

• 发表时间: 2006
• 期刊: J.Mol.Catal.B 42(3-4)
• 作者: Tsutsumi;Maiko. et al.
• 通讯作者: Maiko. et al.