新しいタイプのシアン耐性キノール酸化酵素を標的とするシャーガス病治療薬開発

针对新型抗氰对苯二酚氧化酶的恰加斯病药物的开发

• 批准号: 05J03183
• 负责人: 鈴木 光子
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Nagoya City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J03183/
• 关键词: クルーズトリパノソーマ; シアン耐性キノール酸化酵素; ミトコンドリア; 電子伝達系; シャーガス病

1.クルーズトリパノソーマ原虫キノール酸化酵素の酵素学的解析クルーズトリパノソーマ原虫ゲノムに見いだした新しいタイプのシアン耐性キノール酸化酵素(TcrAOX)について、酵素活性の詳細な検討を行うため、リコンビナントTcrAOX(rTcrAOX)を作成し、大量調製系構築の条件検討を行った。その結果、rTcrAOXを大腸菌で発現させる際、内在性のシトクロームbo、bd活性を除去した(Δbo, Δbd)大腸菌を用いることにより、大腸菌の末端酸化酵素活性はすべてrTcrAOX活性に依存する系の作製に成功した。大量培養を行った大腸菌の膜画分を回収し、ユビキノール酸化活性を測定した結果、ユビキノール酸化活性が見られた。従って、rTcrAOXはユビキノール酸化活性を有していることが明らかとなった。さらに、阻害剤を用いた解析により、これまでのAOXの常識を覆して、その活性はシアン感受性であることが初めて明らかとなった。2.クルーズトリパノソーマ原虫におけるTcrAOXの強制発現昨年度までに、クルーズトリパノソーマ原虫の全てのライフステージでTcrAOXが発現していることが明らかとなった。そこで、原虫におけるTcrAOXの生物学的機能を解析するため、原虫で過剰発現させるためのプロモーターを組み込んだpTEXベクターにTcrAOXを組み込み、エレクトロポレーションによりエピマスティゴートに導入した。薬剤によるセレクション後、原虫を回収し、TcrAOX遺伝子特異的なプライマーを用いたRT-PCT、また、TcrAOX特異抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、発現の上昇を確認した。強制発現原虫のミトコンドリア画分を精製し、ユビキノール酸化活性を測定した結果、コントロールと比較して2.5倍のユビキノール酸化活性が見られた。その値は、過剰発現したTcrAOXタンパク質量の差とほぼ一致しており、今回見られたユビキノール酸化活性が過剰発現したTcrAOXタンパク質によるものであることを示していた。また、TcrAOXを過剰発現した原虫において、その増殖曲線を作成したところ、エピマスティゴート、トリポマスティゴート両ステージにおいて、野生型(WT)との有意な差は認められなかった。そこで、強制発現されるTcrAOXタンパク質の量をさらに過剰にするため、タンパク質への翻訳をさらに促進する新たなベクターを構築し、エレクトロポレーションにて導入した。現在、過剰発現原虫の回収作業を進めている。

1. ク ル ー ズ ト リ パ ノ ソ ー マ parasite キ ノ ー learn analytical ク ル acidification enzymes の enzyme ル ー ズ ト リ パ ノ ソ ー マ parasite ゲ ノ ム に see い だ し た new し い タ イ プ の シ ア ン patience キ ノ ー ル acidification enzyme (TcrAOX) に つ い て, enzyme activity の detailed な 検 line for を う た め, リ コ ン ビ ナ ン ト TcrAOX (rTcrA OX)を is made into を, and a large number of modulation systems are constructed under <s:1> conditions 検 for を lines った. そ の results, rTcrAOX を coliform で 発 now さ せ る interstate, internality の シ ト ク ロ ー ム bo, bd activity を remove し た (Δ bo, Δ bd) coliform を with い る こ と に よ り, coliform の end acidification enzyme activity は す べ て に rTcrAOX activity dependent す る is の cropping に successful し た. Mass culture line を っ た coliform の membrane draw points を 収 back し, ユ ビ キ ノ ー ル acidification determination of active を し た results, ユ ビ キ ノ ー ル acidification active が see ら れ た. Youdaoplaceholder0, rTcrAOX ユビキノ ユビキノ ユビキノ ら the acidification activity of を is manifested in とが て る る とが とが and ら となった となった となった. さ ら に, resistance against tonic を い た parsing に よ り, こ れ ま で の AOX の sense を fu し て, そ の active は シ ア ン susceptibility で あ る こ と が early め て Ming ら か と な っ た. 2. ク ル ー ズ ト リ パ ノ ソ ー マ parasite に お け る TcrAOX の mandatory annual ま 発 now yesterday で に, ク ル ー ズ ト リ パ ノ ソ ー マ parasite の full て の ラ イ フ ス テ ー ジ で TcrAOX が 発 now し て い る こ と が Ming ら か と な っ た. そ こ で, protozoon に お け る TcrAOX の biology function analytical す を る た め, protozoon で turning 発 now さ せ る た め の プ ロ モ ー タ ー を group み 込 ん だ pTEX ベ ク タ ー に TcrAOX を group み 込 み, エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン に よ り エ ピ マ ス テ ィ ゴ ー ト に import し た. 薬 tonic に よ る セ レ ク シ ョ ン, protozoon を back after 収 し, TcrAOX but 伝 specific な プ ラ イ マ ー を with い た RT - PCT, ま た, TcrAOX specific antibody を い た ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ に よ り, 発 now rising の を confirm し た. Mandatory 発 now parasite の ミ ト コ ン ド リ ア draw points を refined し, ユ ビ キ ノ ー ル acidification determination of active を し た results, コ ン ト ロ ー ル と compare し て 2.5 times の ユ ビ キ ノ ー ル acidification active が see ら れ た. そ の numerical は, turning 発 now し た TcrAOX タ ン パ ク poor quality の と ほ ぼ consistent し て お り, today toodles ら れ た ユ ビ キ ノ ー ル が acidification activity through turning 発 now し た TcrAOX タ ン パ ク qualitative に よ る も の で あ る こ と を shown し て い た. ま た, TcrAOX を before turning 発 now し た parasite に お い て, そ の raised yield curve を made し た と こ ろ, エ ピ マ ス テ ィ ゴ ー ト, ト リ ポ マ ス テ ィ ゴ ー ト struck ス テ ー ジ に お い て, wild type (WT) と の intentionally な poor は recognize め ら れ な か っ た. そ こ で, forced 発 now さ れ る TcrAOX タ ン パ ク quality の quantity を さ ら に before turning に す る た め, タ ン パ ク qualitative へ の turn 訳 を さ ら に promote す る new た な ベ ク タ ー を constructing し, エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン に て import し た. Now, in the past, protozoan copy recovery operation を enters めて めて る る.

项目成果

Trypanosoma brucei vacuolar protein sorting 41 (VPS41) is required for intracellular iron utilization and maintenance of normal cellular morphology.

布氏锥虫液泡蛋白分选 41 (VPS41) 是细胞内铁利用和维持正常细胞形态所必需的。

• 发表时间: 2007
• 期刊: Parasitology. 134
• 作者: Lu S;Suzuki T;Iizuka N;Ohshima S;Yabu Y;Suzuki M;Wen L;Ohta N.
• 通讯作者: Ohta N.

Mutational analysis of the Trypanosoma vivax alternative oxidase : the E(X)_6 Y motif is conserved in both mitochondrial alternative oxidase and plastid terminal oxidase and is indispensable for enzyme activity.

间日锥虫替代氧化酶的突变分析：E(X)_6 Y基序在线粒体替代氧化酶和质体末端氧化酶中都是保守的，并且对于酶活性是不可或缺的。

• 发表时间: 2005
• 期刊: Biochem.Biophys.Res.Commun. 334
• 作者: 山崎敏明;源野広和;能勢 博;中村 公亮 et al.
• 通讯作者: 中村 公亮 et al.

Alternative Oxidase (AOX) Genes of African Trypanosomes : Phylogeny and Evolution of AOX and Plastid Terminal Oxidase Families

非洲锥虫的替代氧化酶 (AOX) 基因：AOX 和质体末端氧化酶家族的系统发育和进化

• 发表时间: 2005
• 期刊: The Journal of Eukaryotic Microbiology 52
• 作者: Suzuki T;Hashimoto T;Yabu Y;Majiwa PA;Ohshima S;Suzuki M;Lu S;Hato M;Kido Y;Sakamoto K;Nakamura K;Kita K;Ohta N
• 通讯作者: Ohta N