蛍光イメージングによるmRNAスプライシングと核外輸送の生細胞内可視化解析

真核細胞内におけるmRNAの転写合成からスプライシング及び細胞質への輸送過程は、複雑かつ精密なネットワークシステム下で行われている。mRNAの核外輸送はスプライシング反応と密接に連携して反応を進行させていることが示されており、この連携において非常に重要な役割を果たすと考えられているのが核スペックルである。しかし、核スペックルの形成分子メカニズム及び機能に関しては、未だ不明な点が多い。そこで、核スペックルを阻害する天然化合物の同定を行い、核スペックルの機能を明らかにすることを目的として本年度の実験を行った。核スペックルの形成を阻害する天然化合物のスクリーニングを放線菌培養上清を用いて行った。放線菌培養上清をHeLa細胞培養液に添加後、抗体染色を用いた蛍光イメージングによりスプライシング因子SF2の局在観察を行い、核スペックルの変化を観察した。これまでに、2016サンプルの培養上清について一次スクリーニングを行い、核スペックルの形成に異常が見られた候補上清15サンプルを同定した。それらのうち、例えば放線菌培養サンプル1895-13aで処理した細胞では、SF2の核スペックルへの局在が消失し、核小体を含む核全体に拡散する表現型を示した。次に、候補サンプルによるスプライシング反応に対する影響を調べるため、RT-PCRを用いてレポーター遺伝子1種と内在性の遺伝子4種のスプライシングパターンを解析した。その結果、培養サンプル1895-13aで処理すると、スプライシング因子の活性制御に関与するCLK/Sty(リン酸化酵素)遺伝子のエキソンスキップを伴う選択的スプライシングに影響が生じることなどが示された。候補上清1895-13aに含まれている活性物質の精製を行った結果、スタウロスポリン類縁体を同定した。現在、他の候補サンプルから核スペックルの形成阻害活性を示す化合物の精製を進めている。

真核細胞内におけるmRNAの転写合成からスプライシング及び細胞質への輸送過程は、複雑かつ精密なネットワークシステム下で行われている。mRNAの核外輸送はスプライシング反応と密接に連携して反応を進行させていることが示されており、この連携において非常に重要な役割を果たすと考えられているのが核スペックルである。しかし、核スペックルの形成分子メカニズム及び機能に関しては、未だ不明な点が多い。そこで、核スペックルを阻害する天然化合物の同定を行い、核スペックルの機能を明らかにすることを目的として本年度の実験を行った。核スペックルの形成を阻害する天然化合物のスクリーニングを放線菌培養上清を用いて行った。放線菌培養上清をHeLa細胞培養液に添加後、抗体染色を用いた蛍光イメージングによりスプライシング因子SF2の局在観察を行い、核スペックルの変化を観察した。これまでに、2016サンプルの培養上清について一次スクリーニングを行い、核スペックルの形成に異常が見られた候補上清15サンプルを同定した。それらのうち、例えば放線菌培養サンプル1895-13aで処理した細胞では、SF2の核スペックルへの局在が消失し、核小体を含む核全体に拡散する表現型を示した。次に、候補サンプルによるスプライシング反応に対する影響を調べるため、RT-PCRを用いてレポーター遺伝子1種と内在性の遺伝子4種のスプライシングパターンを解析した。その結果、培養サンプル1895-13aで処理すると、スプライシング因子の活性制御に関与するCLK/Sty(リン酸化酵素)遺伝子のエキソンスキップを伴う選択的スプライシングに影響が生じることなどが示された。候補上清1895-13aに含まれている活性物質の精製を行った結果、スタウロスポリン類縁体を同定した。現在、他の候補サンプルから核スペックルの形成阻害活性を示す化合物の精製を進めている。