蛍光イメージングによるmRNAスプライシングと核外輸送の生細胞内可視化解析

使用荧光成像对 mRNA 剪接和核输出进行活细胞可视化分析

• 批准号: 05J05166
• 负责人: 徳永 和明
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J05166/
• 关键词: 核スペックル; 蛍光イメージング; 遺伝子発現; 阻害化合物; スプライシング; 阻害剤; Microinjection; 蛍光標識mRNA; TIDR

真核細胞内におけるmRNAの転写合成からスプライシング及び細胞質への輸送過程は、複雑かつ精密なネットワークシステム下で行われている。mRNAの核外輸送はスプライシング反応と密接に連携して反応を進行させていることが示されており、この連携において非常に重要な役割を果たすと考えられているのが核スペックルである。しかし、核スペックルの形成分子メカニズム及び機能に関しては、未だ不明な点が多い。そこで、核スペックルを阻害する天然化合物の同定を行い、核スペックルの機能を明らかにすることを目的として本年度の実験を行った。核スペックルの形成を阻害する天然化合物のスクリーニングを放線菌培養上清を用いて行った。放線菌培養上清をHeLa細胞培養液に添加後、抗体染色を用いた蛍光イメージングによりスプライシング因子SF2の局在観察を行い、核スペックルの変化を観察した。これまでに、2016サンプルの培養上清について一次スクリーニングを行い、核スペックルの形成に異常が見られた候補上清15サンプルを同定した。それらのうち、例えば放線菌培養サンプル1895-13aで処理した細胞では、SF2の核スペックルへの局在が消失し、核小体を含む核全体に拡散する表現型を示した。次に、候補サンプルによるスプライシング反応に対する影響を調べるため、RT-PCRを用いてレポーター遺伝子1種と内在性の遺伝子4種のスプライシングパターンを解析した。その結果、培養サンプル1895-13aで処理すると、スプライシング因子の活性制御に関与するCLK/Sty(リン酸化酵素)遺伝子のエキソンスキップを伴う選択的スプライシングに影響が生じることなどが示された。候補上清1895-13aに含まれている活性物質の精製を行った結果、スタウロスポリン類縁体を同定した。現在、他の候補サンプルから核スペックルの形成阻害活性を示す化合物の精製を進めている。

Eukaryotic cells に お け る mRNA の planning write synthetic か ら ス プ ラ イ シ ン グ and び cytoplasm へ は の conveying process, the complex 雑 か つ precision な ネ ッ ト ワ ー ク シ ス テ ム で line under わ れ て い る. MRNA の nucleus delivery は ス プ ラ イ シ ン グ anti 応 と contact に し link-up て anti 応 を for さ せ て い る こ と が shown さ れ て お り, こ の に link-up お い て very important な に "を cut fruit た す と exam え ら れ て い る の が nuclear ス ペ ッ ク ル で あ る. The formation of molecules メカニズム and び functions に is related to <s:1> て, and the だ unknown な points が are numerous が. そ こ で, nuclear ス ペ ッ ク ル を resistance against す る natural compounds の い set を row, nuclear ス ペ ッ ク ル の function を Ming ら か に す る こ と を purpose と し て の this year be 験 を line っ た. Nuclear ス ペ ッ ク ル の form を resistance against す る natural compounds の ス ク リ ー ニ ン グ を actinomycetes culture supernatant を with い て line っ た. Actinomycetes culture supernatant を に HeLa broth, antibody staining after adding を with い た 蛍 light イ メ ー ジ ン グ に よ り ス プ ラ イ シ ン グ factor SF2 の bureau in 観 examine を い, nuclear ス ペ ッ ク ル の variations change を 観 examine し た. こ れ ま で に, 2016 サ ン プ ル の culture supernatant に つ い て a ス ク リ ー ニ ン グ を い, nuclear ス ペ ッ ク ル の forming abnormal に が see ら れ た alternate on qing 15 サ ン プ ル を with fixed し た. そ れ ら の う ち, example え ば actinomycetes cultivate サ ン プ ル 1895-13 a で 処 Richard し た cells で は, SF2 の nuclear ス ペ ッ ク ル へ の bureau disappeared in が し, nucleosome を containing all the に む nuclear company, scattered す る phenotype を shown し た. に, alternate サ ン プ ル に よ る ス プ ラ イ シ ン グ anti 応 に す seaborne る influence を adjustable べ る た め, rt-pcr を with い て レ ポ ー タ ー heritage 伝 child 1 kind of interiority と の heritage 伝 child four の ス プ ラ イ シ ン グ パ タ ー ン を parsing し た. そ の results and cultivate サ ン プ ル 1895-13 a で 処 Richard す る と, ス プ ラ イ シ ン グ factor の activity suppression に masato and す る CLK/Sty (リ ン acidification enzyme) heritage 伝 son の エ キ ソ ン ス キ ッ プ を with う sentaku of ス プ ラ イ シ ン グ に influence が raw じ る こ と な ど が shown さ れ た. Alternate supernatant 1895-13 a に containing ま れ て い る line active substances の refined を っ た results, ス タ ウ ロ ス ポ リ ン class try body を be し た. Now, he の alternate サ ン プ ル か ら nuclear ス ペ ッ ク ル の formation resistance against active を の refined を す compounds into め て い る.

项目成果

核スペックル形成阻害化合物のスクリーニング

筛选抑制核斑点形成的化合物

• 发表时间: 2007
• 作者: R.L.Ohniwa;K.Morikawa;J.Kim;T.Ohta;A.Ishihama;C.Wada;K.Takeyasu;徳永和明
• 通讯作者: 徳永和明

Nucleocytoplasmic transport of fluorescent mRNA in living mammalian cells: nuclear mRNA export is coupled to ongoing gene transcription

• DOI: 10.1111/j.1365-2443.2006.00936.x
• 发表时间: 2006-03-01
• 期刊: GENES TO CELLS
• 影响因子: 2.1
• 作者: Tokunaga, K;Shibuya, T;Tani, T
• 通讯作者: Tani, T

Monitoring mRNA export.

监测 mRNA 输出。

• 发表时间: 2008
• 期刊: Current Protocols in Cell Biology (in press)
• 作者: 石黒 啓一郎;藤山 紗理;南部 あや;加藤 茂明;渡邊 嘉典;Sunada et al.;吉田 貴人;Nabeta Tomohiro;Nabeta Tomohiro;Nabeta Tomohiro;Nabeta Tomohiro;鍋田智広;王 幡;王 幡;王 幡;Akiko Harada;原田 晶子;Kazuaki Tokunaga and Tokio Tani
• 通讯作者: Kazuaki Tokunaga and Tokio Tani

S1-1 nuclear domains: characterization and dynamics as a function of transcriptional activity

• DOI: 10.1042/bc20070142
• 发表时间: 2008-09-01
• 期刊: BIOLOGY OF THE CELL
• 影响因子: 2.7
• 作者: Inoue, Akira;Tsugawa, Katsuji;Tani, Tokio
• 通讯作者: Tani, Tokio