酵素反応と電気化学を利用した早期ガン診断方法の開発

开发利用酶反应和电化学的早期癌症诊断方法

• 批准号: 05J06546
• 负责人: 佐藤 しのぶ
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kyushu Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J06546/
• 关键词: フェロセン化ナフタレンジイミド; 電気化学; RNase A; mRNA; テロメラーゼ; 四本鎖DNA; ガン診断; DNA; 酵素反応

1電気化学的テロメラーゼ活性検出において、申請者らが開発した7種類のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体(FND)について、テロメラーゼ活性に及ぼすFNDの影響をTRAPアッセイにより評価したところ、6種類のものにテロメラーゼ活性阻害能が認められた。1種類については、テロメラーゼ活性をほとんど阻害しないことが明らかとなり、これを用いて培養細胞抽出液の電気化学測定を行い、テロメラーゼ活性の検出が可能であることが明らかとなった。2申請者らが開発したFND誘導体を用いて、テロメラーゼに変わる新たな酵素としてRNase Aをターゲットとした電気化学的酵素アッセイについて検討を行った。RNase Aは、一本鎖RNA分解酵素である。RNase Aは、RNAを用いる実験において、それによる汚染を避けなければならない酵素であるが、人の唾液、汗などに存在するため、これらを防ぐのは非常に大変であり、現在RNase A汚染を確認する手法は、蛍光法しか存在しない。そのため、電気化学的手法により簡便にRNase A活性を確認する手法の確立を試みた。検出原理を以下に示す。電極上にRNase Aの基質となるmRNAを固定化し、RNase Aを含む水溶液で電極を処理する。RNase Aにより電極表面のmRNAが切断され、電極上から遊離すると、電極上のmRNA量が減少する。RNase A処理前後で電極表面上のmRNA量が異なるため、これをFND誘導体で検出する。RNase Aの基質としてmRNA(Poly(A)+RNA, from Mouse Kidney)を用いた。mRNA固定化金電極を調整し、各種濃度のRNase A水溶液にmRNA固定化金電極を浸した時の電流減少率を確認したところ、RNase A濃度の増加に伴い、電流減少率が大きくなった。このことは、溶液中に高濃度のRNase Aが存在すれば、電極上の多くのmRNAが切断され、mRNA量が減少し、それに伴うFNDよる応答が小さくなったことを示している。本手法により、0.2ng/mL-10ng/mLの範囲で定量的な変化を確認することができ、これらの検出限界は、既存の蛍光法と同程度であり、本手法が簡便なRNase A検出法として有用であることが明らかとなった。

1 electric 気 chemical テ ロ メ ラ ー ゼ active 検 out に お い て, applicants ら が open 発 し た 7 kinds の フ ェ ロ セ ン change ナ フ タ レ ン ジ イ ミ ド inductor (FND) に つ い て, テ ロ メ ラ ー ゼ active に and ぼ す FND の influence を TRAP ア ッ セ イ に よ り review 価 し た と こ ろ, 6 species の も の に テ ロ メ ラ ー ゼ active resistance to harm can が recognition Youdaoplaceholder0. 1 species に つ い て は, テ ロ メ ラ ー ゼ active を ほ と ん ど resistance against し な い こ と が Ming ら か と な り, こ れ を with い て culture cell extract の electric line 気 chemical determination of を い, テ ロ メ ラ ー ゼ active の 検 out が may で あ る こ と が Ming ら か と な っ た. 2 applicants ら が open 発 し た FND inductor を with い て, テ ロ メ ラ ー ゼ に - わ る new た な enzyme と し て RNase A を タ ー ゲ ッ ト と し た electric 気 chemical enzyme ア ッ セ イ に つ い て 検 line for を っ た. RNase A である, a lock-locked rnA-decomposing enzyme である. RNase A は, RNA を い る be 験 に お い て, そ れ に よ る avoid pollution を け な け れ ば な ら な い enzyme で あ る が, people の saliva, sweat な ど に exist す る た め, こ れ ら を anti ぐ の は very big に - で あ り, RNase A pollution を now confirm す る は, 蛍 method し か exist し な い. Youdaoplaceholder0 ため, electrochemical method によ, <s:1> simplicity にRNase A activity を confirmation する method を establishment を test みた. The principle of 検 is を. The following に shows す. Youdaoplaceholder0 RNase A <s:1> matrix となるmRNAを immobilization を on the electrode, RNase Aを with む aqueous solution で electrode を treatment する. RNase A に よ り electrode surface の mRNA が cut さ れ, electrode か ら free す る と, electrode の mRNA decrease が す る. Before and after RNase A treatment, the amount of <s:1> mRNA on the で electrode surface が was different from なるため, and the <s:1> れをFND inducer で検 was released する. RNase A <s:1> matrix と て てmRNA(Poly(A)+RNA, from Mouse Kidney)を with と た. MRNA immobilized gold electrode を adjustment し, concentration of various の RNase A aqueous に mRNA immobilized gold electrode を し た の current decrement を confirm し た と こ ろ, RNase A concentration の raised に い, current decrement が big き く な っ た. こ の こ と は high concentrations, solution に の RNase A が exist す れ ば, electrode の く の mRNA が cut さ れ, が reduce し mRNA, そ れ に with う FND よ る 応 answer が small さ く な っ た こ と を shown し て い る. This technique に よ り, 0.2 ng/mL - 10 ng/mL の van 囲 で quantitative な variations change を confirm す る こ と が で き, こ れ ら の 検 gauge は, existing の 蛍 と light method with degree of で あ り, this technique easy が な RNase A 検 out method と し て useful で あ る こ と が Ming ら か と な っ た.

项目成果

テロメラーゼ活性の電気化学的検出方法及びそれに用いる検出キット

端粒酶活性的电化学检测方法及其所用的检测试剂盒

• 发表时间: 2005

Linker effect of ferrocenylnaphthalene diimide ligands in the interaction with double stranded DNA

二茂铁基萘二酰亚胺配体与双链DNA相互作用中的接头效应

• 发表时间: 2008
• 期刊: Journal of Organometallic Chemistry 693
• 作者: Takuya Awata;et al.;Tetsuro Kobayashi et al.;Hiroshi Ikegami;Eiji Kawasaki;Shinobu Sato
• 通讯作者: Shinobu Sato

フェロセン化ナフタレンジイミドを利用した電気化学的テロメラーゼ活性検出法の開発

二茂铁萘二酰亚胺电化学端粒酶活性检测方法的建立

• 发表时间: 2008
• 作者: Takuya Awata;et al.;Tetsuro Kobayashi et al.;Hiroshi Ikegami;Eiji Kawasaki;Shinobu Sato;Shinobu Sato;Masanori Kanazawa;Masanori Kanazawa;佐藤 しのぶ;佐藤 しのぶ;佐藤 しのぶ;佐藤 しのぶ;佐藤 しのぶ;佐藤 しのぶ;佐藤 しのぶ
• 通讯作者: 佐藤 しのぶ

Linker chain efect of ferrocenylnaphthalene diimide derivatives on a tetraplex DNA binding

二茂铁基萘二酰亚胺衍生物对四链体 DNA 结合的连接链效应

• 发表时间: 2006
• 期刊: Nucleic Acids Symposium Series 50
• 作者: Takuya Awata;et al.;Tetsuro Kobayashi et al.;Hiroshi Ikegami;Eiji Kawasaki;Shinobu Sato;Shinobu Sato;Masanori Kanazawa;Masanori Kanazawa;佐藤 しのぶ;佐藤 しのぶ;佐藤 しのぶ
• 通讯作者: 佐藤 しのぶ

Electrochamical detection of telomeric quadruplex DNA using ferrocenyl naphthalene diimide

使用二茂铁基萘二酰亚胺电化学检测端粒四链体 DNA

• 发表时间: 2005
• 期刊: Nucleic Acids Symposium Series 49
• 作者: Takuya Awata;et al.;Tetsuro Kobayashi et al.;Hiroshi Ikegami;Eiji Kawasaki;Shinobu Sato;Shinobu Sato;Masanori Kanazawa;Masanori Kanazawa;佐藤 しのぶ;佐藤 しのぶ;佐藤 しのぶ;佐藤 しのぶ;佐藤 しのぶ
• 通讯作者: 佐藤 しのぶ