酵素反応と電気化学を利用した早期ガン診断方法の開発

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1電気化学的テロメラーゼ活性検出において、申請者らが開発した7種類のフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体(FND)について、テロメラーゼ活性に及ぼすFNDの影響をTRAPアッセイにより評価したところ、6種類のものにテロメラーゼ活性阻害能が認められた。1種類については、テロメラーゼ活性をほとんど阻害しないことが明らかとなり、これを用いて培養細胞抽出液の電気化学測定を行い、テロメラーゼ活性の検出が可能であることが明らかとなった。2申請者らが開発したFND誘導体を用いて、テロメラーゼに変わる新たな酵素としてRNase Aをターゲットとした電気化学的酵素アッセイについて検討を行った。RNase Aは、一本鎖RNA分解酵素である。RNase Aは、RNAを用いる実験において、それによる汚染を避けなければならない酵素であるが、人の唾液、汗などに存在するため、これらを防ぐのは非常に大変であり、現在RNase A汚染を確認する手法は、蛍光法しか存在しない。そのため、電気化学的手法により簡便にRNase A活性を確認する手法の確立を試みた。検出原理を以下に示す。電極上にRNase Aの基質となるmRNAを固定化し、RNase Aを含む水溶液で電極を処理する。RNase Aにより電極表面のmRNAが切断され、電極上から遊離すると、電極上のmRNA量が減少する。RNase A処理前後で電極表面上のmRNA量が異なるため、これをFND誘導体で検出する。RNase Aの基質としてmRNA(Poly(A)+RNA, from Mouse Kidney)を用いた。mRNA固定化金電極を調整し、各種濃度のRNase A水溶液にmRNA固定化金電極を浸した時の電流減少率を確認したところ、RNase A濃度の増加に伴い、電流減少率が大きくなった。このことは、溶液中に高濃度のRNase Aが存在すれば、電極上の多くのmRNAが切断され、mRNA量が減少し、それに伴うFNDよる応答が小さくなったことを示している。本手法により、0.2ng/mL-10ng/mLの範囲で定量的な変化を確認することができ、これらの検出限界は、既存の蛍光法と同程度であり、本手法が簡便なRNase A検出法として有用であることが明らかとなった。