ジビニルプロトクロロフィリド還元酵素の遺伝子の単離と酵素学的解析

本研究はクロロフィルa合成経路の3,8-ジビニルクロロフィリドa 8-ビニルレダクターゼ(DVR)遺伝子から見た、クロロフィル合成経路と光合成生物の進化の関係に対する理解を深めることを目的としている。昨年度までの研究で、私はシロイヌナズナのDVR(AtDVR)の酵素的性質からクロロフィル合成経路の一部を改定することを提案した。この研究結果は現在投稿中である。本年度はDVR遺伝子の進化の矛盾に取り組んだ。AtDVRはクロロフィル合成経路の中でジビニルクロロフィリドaをモノビニルクロロフィリドaに還元するため、DVRはモノビニルクロロフィルを利用する光合成生物にとって必須の酵素であると考えられる。しかし全ゲノム配列が決定している光合成細菌を含めた光合成生物の中に、AtDVRホモログを持たない種が存在した。私はAtDVRホモログを持たなかったラン藻Synechocystis sp.PCC6803から新規のDVRを単離し、DVR遺伝子の進化を解明することを試みた。Synechocystisから精製したチラコイド膜はAtDVRと同様の条件で、ジビニルクロロフィリドaをモノビニルクロロフィリドaに変換した。チラコイド膜を可溶化し、陰イオン交換カラム、ゲルろ過カラムを使ってタンパク質の精製を行い、新規DVRタンパク質を含む画分を得ることができた。その画分をSDS-PAGEで分離し、数種のタンパク質の質量分析を行った。しかし、その結果から新規DVRの候補となったslr0645、slr0942遺伝子は、大腸菌発現タンパク質を用いたDVR活性測定で活性を示さなかった。今後、本研究室ではSynechocystisで上記の2つの遺伝子の欠損株の作成、異なる界面活性剤でのチラコイド膜の可溶化の条件検討、二次元電気泳動によって新規DVRタンパク質の精製度を高め、必ず同定することを目標としている。

本研究はクロロフィルa合成経路の3,8-ジビニルクロロフィリドa 8-ビニルレダクターゼ(DVR)遺伝子から見た、クロロフィル合成経路と光合成生物の進化の関係に対する理解を深めることを目的としている。昨年度までの研究で、私はシロイヌナズナのDVR(AtDVR)の酵素的性質からクロロフィル合成経路の一部を改定することを提案した。この研究結果は現在投稿中である。本年度はDVR遺伝子の進化の矛盾に取り組んだ。AtDVRはクロロフィル合成経路の中でジビニルクロロフィリドaをモノビニルクロロフィリドaに還元するため、DVRはモノビニルクロロフィルを利用する光合成生物にとって必須の酵素であると考えられる。しかし全ゲノム配列が決定している光合成細菌を含めた光合成生物の中に、AtDVRホモログを持たない種が存在した。私はAtDVRホモログを持たなかったラン藻Synechocystis sp.PCC6803から新規のDVRを単離し、DVR遺伝子の進化を解明することを試みた。Synechocystisから精製したチラコイド膜はAtDVRと同様の条件で、ジビニルクロロフィリドaをモノビニルクロロフィリドaに変換した。チラコイド膜を可溶化し、陰イオン交換カラム、ゲルろ過カラムを使ってタンパク質の精製を行い、新規DVRタンパク質を含む画分を得ることができた。その画分をSDS-PAGEで分離し、数種のタンパク質の質量分析を行った。しかし、その結果から新規DVRの候補となったslr0645、slr0942遺伝子は、大腸菌発現タンパク質を用いたDVR活性測定で活性を示さなかった。今後、本研究室ではSynechocystisで上記の2つの遺伝子の欠損株の作成、異なる界面活性剤でのチラコイド膜の可溶化の条件検討、二次元電気泳動によって新規DVRタンパク質の精製度を高め、必ず同定することを目標としている。