ペプチド核酸を用いた生細胞内のRNA動態の1分子リアルタイムイメージング

使用肽核酸对活细胞中 RNA 动态进行单分子实时成像

• 批准号: 05J11597
• 负责人: 岡部 弘基
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J11597/
• 关键词: mRNA; 蛍光イメージング; 2'0-methy1 RNA; 蛍光相関分光法; 細胞; アンチセンス分子; FRET; 人工核酸; 2'OMe-RNA; PNA; ハイブリダイゼーション

本研究は、生きた細胞内に内在している特定のmRNAを特異的に検出し、さらにその発現量を定量化することを目的として行った。特定のmRNAを可視化するために、異なる蛍光団で標識した2種アンチセンス分子の標的RNAへの相補結合に伴うFRETによる検出を考案した。前年度までに、人工核酸アンチセンスプローブを用いて、生きた細胞内に内在するc-fos mRNAのリアルタイムイメージング法を確立した。本年度は確立したmRNA検出法を応用して、生きた細胞内における内在性mRNAの定量化を試みた。細胞内に導入したアンチセンスプローブは、細胞に内在するc-fos mRNAとの結合により分子量が増大するため、蛍光相関分光法(FCS)により未結合のプローブと分離して定量できると考えた。まずin vitroにて、c-fos mRNAの定量を行った。チューブ内でc-fos mRNAとCy3標識アンチセンス2'O-methyl RNAプローブを混合後、FCSにより解析した。mRNAとの結合型及び非結合型のプローブを、それぞれの拡散時間の違いから分離して定量することが出来た。さらに、一定濃度のmRNAと混合した種々濃度のアンチセンスプローブのFCS測定を行い、その結合比率から、アンチセンスプローブとc-fos mRNAとの解離定数を算出した。得られた解離定数と結合率から算出したmRNAの濃度は、吸光度から定量した濃度とほぼ一致した。続いて、定量法を生きた細胞内に応用するためCos7細胞にプローブを導入後、FCS解析を行った結果、細胞内においても、mRNAとの結合型、非結合型のプローブを同様に分離して定量することが出来た。さらに導入したプローブ濃度と結合率から、細胞内における解離定数を算出し、同様に個々の細胞における内在性c-fos mRNAの濃度の定量を初めて達成した。

This study は, raw き に た cell inner し て い る specific の mRNA を specific に 検 し, さ ら に そ の 発 now quantity を quantitative す る こ と を purpose と し て line っ た. Specific の mRNA を visualization す る た め に, different な る 蛍 light 団 で logo し た two ア ン チ セ ン ス RNA molecules の mark へ phase の fill with に with う FRET に よ る 検 out を test case し た. Before the annual ま で に, artificial nucleic acid ア ン チ セ ン ス プ ロ ー ブ を with い て, raw き に た cell inner す る c - fos mRNA の リ ア ル タ イ ム イ メ ー ジ ン を グ method established し た. This year, 検 established the 検 mRNA検 extraction method を応 using <s:1> て and the における intrinsic mRNA in <s:1> た cells of living <s:1> た to quantitatively を test みた. Intracellular に import し た ア ン チ セ ン ス プ ロ ー ブ は, cell に inner す る c - fos mRNA と の combining に よ り が raised large molecular weight す る た め masato, 蛍 optical phase spectrometry (FCS) に よ り not combine の プ ロ ー ブ と separation し て quantitative で き る と exam え た. Youdaoplaceholder0 in vitroにて, c-fos mRNA <s:1> quantification を line った. チ ュ ー ブ で within c - fos mRNA と Cy3 logo ア ン チ セ ン ス 2 'O - methyl RNA プ ロ ー ブ を blend, FCS に よ り parsing し た. MRNA と の combination type and の び non プ ロ ー ブ を, そ れ ぞ れ の company, scattered time の violations い か ら separation し て quantitative す る こ と が た. さ ら に, a certain concentration の mRNA と mixed し た 々 concentration の ア ン チ セ ン ス プ ロ ー ブ の determination of FCS を い, そ の combination ratio か ら, ア ン チ セ ン ス プ ロ ー ブ と - c fos mRNA と の dissociation constant を calculate し た. The られた dissociation number と binding rate ら ら is obtained. The <s:1> たmRNA <s:1> concentration <e:1> and absorbance <s:1> ら quantitative <s:1> た concentration とほぼ are calculated to be consistent with た た. 続 い て, quantitative method を raw き た intracellular に 応 with す る た め Cos7 cell に プ ロ ー ブ を after import, FCS analytic line を っ た results, intracellular に お い て も, mRNA と の combination type, the combination type の プ ロ ー ブ を with others に separation し て quantitative す る こ と が た. さ ら に import し た プ ロ ー と ブ concentration rate of combined か ら, intracellular に お け る dissociation constant を calculate し, with others in a 々 に の cells に お け る internality - c fos mRNA の concentration early の quantitative を め て reached し た.