プロテインスプライシングを用いた細胞内におけるタンパク質局在の分析法の開発

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筆者の所属する研究室では、アミノアシル化リボザイムと再構成無細胞翻訳系を用いた非天然アミノ酸含有ペプチド(=特殊ペプチド)の合成に取り組んでいる。本年度は、昨年度に引き続いて、特殊ペプチドの環状化戦略を開発すると共に、合成された環状ペプチドの詳細な活性評価をおこなった。特殊ペプチドの環状化については、昨年度までに1)クロロアセチル基とシステイン側鎖を介したチオエーテル結合の形成2)クリックケミストリーによるトリアゾール骨格を介した環状化、を開発している。そこで、本年度はこれらの方法を組み合わせることによる二環ペプチドの合成に取り組んだ。ペプチド中に非天然アミノ酸を三種類含む特殊ペプチドは効率よく合成され、このペプチドはチオエーテル結合の自発的形成、および銅触媒によるクリック反応を通して二環ペプチドに変換された。システイン側鎖を用いる方法と異なり、分子内反応を位置特異的に制御することができることから、本手法は二環ペプチドの優れた合成方法であると考えられる。チオエーテル型環状化ペプチドについては、生理活性様ペプチドを合成し、その特性について詳細に調べた。ヒト型生理活性ペプチド、ウロテンシンは2つのシステイン側鎖で環状化されているが、この結合をチオエーテルに変換したのち、その生理活性を評価した。生理活性については、ウロテンシンレセプターを発現させた細胞の、カルシウム動員応答を指標に評価した。その結果、チオエーテル型ペプチドは、EC50=4.6±0.58nMという極めて低濃度でカルシウム動員を引き起こすことが示された。一方で、この値は天然型ペプチドのEC50=0.55±0.18nMとう値からは一桁程度上昇していることから、チオエーテル結合の導入により、ペプチドの構造が一部変化していることが示唆された。