高等植物ミトコンドリアゲノム形質転換系の確立

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本年度の研究によって得られた知見を以下に記す。(1)遺伝子銃を用いたシロイヌナズナ巨大化ミトコンドリアに対する遺伝子導入処理前年度に作出に成功した巨大化ミトコンドリアを持つシロイヌナズナ成葉に対して、遺伝子銃を用いたミトコンドリアへの遺伝子導入を試みた。遺伝子導入処理には、ミトコンドリアatp6遺伝子発現調節領域によるGFP遺伝子の発現誘導を想定したベクターを用いて行った。しかし、ミトコンドリア内において導入遺伝子の発現を検出することは出来なかった。この結果を受けて、その原因の追究と技術的な改善を達成する為、以下の研究を行った。(2)巨大化ミトコンドリア内における核様体構造の解析ミトコンドリア内へ導入された遺伝子が正常に発現するためには、その核様体近傍への導入が必須の条件である。しかし、巨大化ミトコンドリア内における核様体のサイズが野生型と同程度であるとすれば、遺伝子導入に用いる金粒子のサイズとの関係上、直接的な遺伝子が導入困難であると予測される。そこで、超巨大化ミトコンドリア内の核様体サイズを検証した。Syber Green 1を用いた観察の結果、シロイヌナズナ成葉における超巨大化ミトコンドリア内の核様体は野生型と比べ、2〜3倍程度の直径を持つことが明らかとなった。しかし、細胞当りの核様体シグナルの数は減少しており、ミトコンドリア核様体への遺伝子導入の障壁となっている可能性が考えられた。(3)卵細胞ミトコンドリアを可視化したシロイヌナズナの作製高等植物の卵細胞ミトコンドリアに関して、これまでの先行研究から、その形態が巨大かつその内部に大量のDNAが包含されていることが報告されている。そこで本研究では、レーザーマイクロインジェクション法によるこの卵細胞ミトコンドリアへの直接的な遺伝子導入を目指し、まず卵細胞ミトコンドリアを特異的に可視化した形質転換シロイヌナズナ系統を作製した。ミトコンドリア内へ導入された遺伝子が正常に発現するためには、その核様体近傍への導入が必須の条件である。しかし、巨大化ミトコンドリア内における核様体のサイズが野生型と同程度であるとすれば、遺伝子導入に用いる金粒子のサイズとの関係上、直接的な遺伝子が導入困難であると予測される。そこで、超巨大化ミトコンドリア内の核様体サイズを検証した。Syber Green 1を用いた観察の結果、シロイヌナズナ成葉における超巨大化ミトコンドリア内の核様体は野生型と比べ、2〜3倍程度の直径を持つことが明らかとなった。しかし、細胞当りの核様体シグナルの数は減少しており、ミトコンドリア核様体への遺伝子導入の障壁となっている可能性が考えられた。(3)卵細胞ミトコンドリアを可視化したシロイヌナズナの作製高等植物の卵細胞ミトコンドリアに関して、これまでの先行研究から、その形態が巨大かつその内部に大量のDNAが包含されていることが報告されている。そこで本研究では、レーザーマイクロインジェクション法によるこの卵細胞ミトコンドリアへの直接的な遺伝子導入を目指し、まず卵細胞ミトコンドリアを特異的に可視化した形質転換シロイヌナズナ系統を作製した。