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コンビナトリアル生合成を指向したインドールジテルペンの酵素的合成

用于组合生物合成的吲哚二萜的酶法合成

基本信息

批准号：
16710150
负责人：
常盤野哲生
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

多様な構造を有するインドールジテルペン化合物の酵素による骨格構築に向け、マイコトキシンであるpaxillineの骨格構築に関わる候補遺伝子を発現し、酵素反応を検討した。paxillineおよびemindole-DAの生合成における鎖状前駆体が3-geranylgeranylindole(GGI)であることは、平成16年度に証明済みである。前年度の結果を踏まえ、鎖状前駆体GGIのエポキシ化および環化を触媒する酵素を特定するべく、酵素活性の検出を試みた。まず、酸化酵素の候補遺伝子(paxM)を発現ベクターpET-28aに組み込み、大腸菌(BL21)内で発現した。菌体を破砕しタンパクの可溶性画分を粗酵素液とした。酸化酵素の反応に通常用いられる補因子(FAD/NADPH,FMN/NADH)を添加して粗酵素液によるGGIのエポキシ化反応を検討した。補因子や緩衝液の組み合わせなど種々の条件で反応を行ったが、これまでのところ活性の検出には成功していない。次に環化酵素の候補遺伝子(paxC)を同様に大腸菌内で発現し、GGIのm-chloroperbenzoic acid処理により別途合成した17,18-epoxy-GGIの取り込み実験を行ったが、環化生成物を検出することは出来なかった。上記の発現系とは別に、インドールジテルペン生産菌の破砕菌体およびミクロソーム画分を用いて、GGI/epoxy-GGIの変換を試みた。反応条件の検討(プロテアーゼ阻害剤、各種補因子や金属イオンの有無など)を種々行ったものの、酵素活性の検出には至らなかった。更にpaxMと類似のエポキシ化機能を有するとされる他の酸化酵素を用いて、反応条件の設定を探ることにした。ポリエーテル系抗生物質の生合成における酸化酵素遺伝子を発現し、GGIと同様の3.置換オレフィンの酸化反応を検討したところ、反応における補因子(FAD/NADPH)を系中で触媒的に再生するためのFAD還元酵素が必要である可能性があり、既知の還元酵素SsuEを外部から添加する反応系を構築した。

There are several kinds of compounds, such as enzyme, paxilline, bone, bone and so on. The precursors 3-geranylgeranylindole (GGI) and emindole-DA were synthesized by paxilline and Pingcheng in 16 years. In the previous year, the results showed that the enzyme activity and activity of the enzyme were tested in the previous year, and the results showed that the enzyme activity was not detected in the previous year. In the previous year, the results of the previous year showed that the enzyme activity of the GGI precursor was tested. PaxM and acidifying enzyme were detected in pET-28a and BL21 respectively. The bacteria were divided into two parts: the crude enzyme solution and the crude enzyme solution. Acidifying enzyme "reverse" is usually used to add the crude enzyme solution (FAD/NADPH,FMN/NADH) to the crude enzyme solution, which is called "GGI". The factors are determined by the combination of various conditions, and the results show that the success of the test is successful. The secondary environmental enzyme phenotype (paxC) was detected in the same bacteria, and GGI m-chloroperbenzoic acid was used to synthesize the enzyme in another way. The environmental products were isolated from the environmental products. The last part of the system is to determine the number of bacteria, GGI/epoxy-GGI, bacteria, bacteria and bacteria. A variety of conditions are used to determine the temperature, and the enzyme activity is released from the temperature to the temperature. The paxM attribute is similar to that of the chemical machine. It is possible to detect the use of acidifying enzymes and reverse the conditions to set the probe temperature. Anti-biotic synthesis, acidification enzyme, GGI homology 3. In the system of acidizing and anti-acidification, the regeneration of the catalyst, the possibility of FAD, the possibility of SsuE and the addition of the known meta-enzyme SsuE were added to the catalysis system.