バクテリアtRNAの修飾機構と病原性発現への関与の解析

本研究では以下の3つの点を目的としている。1)L修飾システムに関連する正確な遺伝暗号解読機構、即ち、L修飾とプロセシングのタイミングに関する解析及びL修飾を欠いたtRNA^<Ile>の細胞内での挙動の解析、2)mnm5U生合成の機構とそのタイミングの解析、3)これら2種の修飾塩基を持つと予想される大腸菌O157株の病原性遺伝子発現における特異的tRNA(IRR)の役割の解明を目的とする。これまでに、1)大腸菌tRNAプロセシング酵素遺伝子の温度感受性株を用いて、細胞内におけるL修飾とプロセシングのタイミング、即ち、どちらの過程が先に起こるかを調べた。その結果、tRNAの5'末端のプロセシングに関わる酵素遺伝子の温度感受性株を高温で培養しても、L修飾が検出された。このことは、プロセシングよりも前にL修飾が起こり、L修飾酵素はtRNA^<Ile>の未成熟体を基質とすることを示している。現在、tRNA^<Ile>の未成熟体のin vitro転写物を作成し、L修飾酵素によるL修飾の酵素速度論解析を行っている。2)枯草菌において、mnm5U生合成に関与する可能性がある遺伝子を同定し、その条件破壊株を作製した。その細胞のtRNAを質量分析により解析した結果、mnm5Uの細胞内量には変動が見られず、mnm5U合成には関与していないことが明らかになった。しかし、当該遺伝子は枯草菌において生育に必須であり、条件破壊株の生育は著しく低下し、細胞内のRNAが部分的に分解しているという結果が得られた。今後はこの遺伝子についてmnm5U合成以外の機能に着目し、解析を続けていく予定である。3)O157株のIRR遺伝子と、それに対応するマイナーコドンを連続してつなげたβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を、非病原性大腸菌に導入し、IRRが対応するマイナーコドンの翻訳に与える影響を調べた。その結果、IRRの存在下では対応するマイナーコドンを含むβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現量が上昇し、IRRが翻訳に積極的に寄与していることが示唆された。現在、O157株のゲノム上の7コピーIRR遺伝子の全てを欠損させた株の構築をすすめている。今後は欠損株の表現型の解析、特に、病原性遺伝子群の発現の変化を、主にウェスタン法を用いて解析する予定である。

本研究では以下の3つの点を目的としている。1)L修飾システムに関連する正確な遺伝暗号解読機構、即ち、L修飾とプロセシングのタイミングに関する解析及びL修飾を欠いたtRNA^<Ile>の細胞内での挙動の解析、2)mnm5U生合成の機構とそのタイミングの解析、3)これら2種の修飾塩基を持つと予想される大腸菌O157株の病原性遺伝子発現における特異的tRNA(IRR)の役割の解明を目的とする。これまでに、1)大腸菌tRNAプロセシング酵素遺伝子の温度感受性株を用いて、細胞内におけるL修飾とプロセシングのタイミング、即ち、どちらの過程が先に起こるかを調べた。その結果、tRNAの5'末端のプロセシングに関わる酵素遺伝子の温度感受性株を高温で培養しても、L修飾が検出された。このことは、プロセシングよりも前にL修飾が起こり、L修飾酵素はtRNA^<Ile>の未成熟体を基質とすることを示している。現在、tRNA^<Ile>の未成熟体のin vitro転写物を作成し、L修飾酵素によるL修飾の酵素速度論解析を行っている。2)枯草菌において、mnm5U生合成に関与する可能性がある遺伝子を同定し、その条件破壊株を作製した。その細胞のtRNAを質量分析により解析した結果、mnm5Uの細胞内量には変動が見られず、mnm5U合成には関与していないことが明らかになった。しかし、当該遺伝子は枯草菌において生育に必須であり、条件破壊株の生育は著しく低下し、細胞内のRNAが部分的に分解しているという結果が得られた。今後はこの遺伝子についてmnm5U合成以外の機能に着目し、解析を続けていく予定である。3)O157株のIRR遺伝子と、それに対応するマイナーコドンを連続してつなげたβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を、非病原性大腸菌に導入し、IRRが対応するマイナーコドンの翻訳に与える影響を調べた。その結果、IRRの存在下では対応するマイナーコドンを含むβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現量が上昇し、IRRが翻訳に積極的に寄与していることが示唆された。現在、O157株のゲノム上の7コピーIRR遺伝子の全てを欠損させた株の構築をすすめている。今後は欠損株の表現型の解析、特に、病原性遺伝子群の発現の変化を、主にウェスタン法を用いて解析する予定である。