ミトコンドリア蛋白質輸送に関わる、局在化配列、細胞質因子、膜透過装置の解析

线粒体蛋白转运中涉及的定位序列、细胞质因子和膜渗透装置的分析

• 批准号: 17770170
• 负责人: 小宮 徹
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Nagahama Institute of Bio-Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17770170/
• 关键词: ミトコンドリア; 膜透過; 前駆体; 細胞内局在; 細胞内タンパク質輸送; 局在化シグナル

本研究の目的は、(A)高等動物に於けるミトコンドリア蛋白質前駆体の輸入反応の素過程を明らかにするため、その初期段階である、「細胞質因子によるミトコンドリア蛋白質前駆体の認識並びにミトコンドリア外膜の受容体へのターゲテイング」に注目し、その分子機構を解明すること、並びに、(B)「一過的なミトコンドリアへの局在化」の分子機構を解明するために、蛋白質合成後、ある条件下でミトコンドリアに局在化することが報告されている蛋白質を用いて、その蛋白質のミトコンドリア局在化配列を明らかにし、その「一過的な局在化」に関わる、細胞質因子並びに膜透過装置を解析することである。(A)に関しては、新規のミトコンドリア前駆体タンパク質の外膜受容体であると考えられる、OM37のノックダウン実験と大腸菌発現系、培養細胞発現系の構築を進めている。(B)に関しては、前年度に引き続いて立命館大学の菊池正和教授との共同研究を進めている。PDIファミリーの一員である、P5が、小胞体だけではなくミトコンドリアにも局在していることが示唆されていたが、前年度に得られた知見に加えて、新たに以下の結果を得ることができた。(1)細胞分画を行うと、ほぼ2:3の割合でミトコンドリアと小胞体に局在していた。(2)ミトコンドリアに局在しているP5は、ミトコンドリアにプロテアーゼ処理を行った場合でも消化されなかった。(3)低張処理によって外膜を破砕したミトプラストを遠心にかけると、ほとんどが沈澱に検出されたものの、上清にもわずかながら検出された。(4)プロテアーゼで処理したミトプラストでは、P5はプロテアーゼに耐性を示した。(5)ミトコンドリアを超音波破砕した後超遠心にかけて沈澱と上清に分離したところ、意外にも、P5は、沈澱にも上清にも検出された。また、沈澱をアルカリ処理すると、そのほとんどが上清に回収された。(6)小胞体画分のコンタミネーションを除去するために、パーコール密度勾配遠心によって、さらにミトコンドリアを精製した。この高純度ミトコンドリアに於いても、P5を検出することができた。(7)免疫電顕による観察の結果、少数ながら、ミトコンドリアに金コロイド粒子を確認することができた。以上の結果から、P5は、ミトコンドリアに存在し、マトリクス並びに膜間腔の可溶性タンパク質としてだけではなく、内膜のマトリクス側の表在性膜タンパク質として存在していることが分かった。以上の結果を論文に発表した(Kimura, T. et al., 2008, J. Biochem., in press)。P5は、アミノ末端に分泌型シグナルペプチドと、カルボキシ末端にKDEL配列を含む、典型的な小胞体残留型タンパク質であり、見かけ上明らかなミトコンドリア局在化シグナルは含んでいない。このような特徴をもつタンパク質が小胞体とミトコンドリアに「二極性局在」を示す例は現在までに報告がない。今後も、これらを解明するためより詳細な研究を計画している。

The purpose of this study is: (A) Transfusion of protein precursors in higher animals Into the anti-reaction factor process を明らかにするため, そのInitial stage である, "cytoplasmic factor によるミトコンドリアProtein precursor body and receptorターゲテイング　　　　　　　　　　　　　　　　　　ifies 　　　　　　　　　　　　、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　logue 　　　　　　　 by することOne-way molecular structure analysis and protein synthesis After the completion, under the conditions of the でミトコンドリアに bureau, the することが report the されている proteinを用いて、そのproteinのミトコンドリアbureau in the chemical arrangement を明らかにし、その「一pass The analysis of the localization of cytoplasmic factors and membrane permeability equipment is done. (A) に关しては, Shingui のミトコンドリア前槆体タンパクquality のOuter membrane receptor であると卡えられる、OM37のノックダウン実験と coliform strain and cultured cell strain are constructed and constructed. (B) The research was carried out jointly by Professor Masakazu Kikuchi of Ritsumeikan University and Professor Toshiko of the previous year. One member of PDI Fukuoka, P5, and the small cell body Fukudaとが见憆されていたが, the previous year's に得られた知见に加えて, the new たにThe following results をget ることができた. (1) Cell division is divided into 2:3 and 2:3 cut and combined cells. (2)Mitsubiru P5は、Mitsubiruアにプロテアーゼdealing with を行ったoccasionでもdigestionされなかった. (3) Hypotonic treatment: outer membrane breaking, telecentric treatment, The ほとんどが precipitated に検出されたものの, the super clear にもわずかながら検出された. (4) プロテアーゼでtreatment したミトプラストでは, P5 はプロテアーゼにresistant をshow した. (5) The supernatant of the supertelecentric precipitate after ultrasonic lysisにSeparation したところ, accident にも, P5 は, precipitation にもsupernatant にも検出された.また, precipitated をアルカリ treatment すると, そのほとんどが supernatant recovery された. (6) Small cells are divided into small cells and divided into small cells. The コール density is combined with the telecentric によって and the さらにミトコンドリアを refined した. High purity ミトコンドリアに in いても, P5 を検出することができた. (7) Immunoelectronic test results, a small number of ながら, ミトコンドリアに金コロイド particle をconfirmation することができた. The above results show that P5 and ミトコンドリアに exist and マトリクス and soluble タンパク substance in the intermembrane cavityしてだけではなく, endometrium のマトリクスlateral surface タンパクquality として presence していることが分かった. The above results are summarized in the paper (Kimura, T. et al., 2008, J. Biochem., in press). P5 は, アミノ terminal secretion type シグナルペプチドと, カルボキシ terminal にKDEL arrangement をcontaining む, typical なSmall cell body residual type タンパク性であり, 见かけ上明らかなミトコンドリアbureau in the change シグナルは炓でいない.このような特徴をもつタンパク色が小码体とミトコンドリアに「二polarity bureau in」をshowす ExampleはNow it is reported by までにがない. From now on, we will explain the details of the research and plan in detail.

项目成果

PDIファミリータンパク質P5は、小胞体とミトコンドリアに局在する

PDI 家族蛋白 P5 定位于内质网和线粒体

• 发表时间: 2007
• 作者: 設楽優;坂本力;木村太地;小宮徹;山本章嗣;菊池正和
• 通讯作者: 菊池正和

Evidence for Mitochondrial Localization of P5, a Member of the Protein Disulfide Isomerase Family

蛋白质二硫键异构酶家族成员 P5 线粒体定位的证据

• 发表时间: 2008
• 期刊: Journal of Biochemistry (印刷中)
• 作者: Kimura;T.;Horibe;T.;Sakamoto;C.;Shitara;Y.;Fujiwara;F.;Komiya;T.;Yamamoto;A.;Hayano;T.;Takahashi;N.;& Kikuchi;M.
• 通讯作者: M.

Mitochondrial Localization of P5, a Member of Protein Disulfide Isomerase Family

蛋白质二硫键异构酶家族成员 P5 的线粒体定位

• 发表时间: 2008
• 作者: Shitara;Y.;Sakamoto;C.;Kimura;T.;Komiya;T.;Yamamoto;A.;& Kikuchi;M.
• 通讯作者: M.