ミトコンドリア蛋白質輸送に関わる、局在化配列、細胞質因子、膜透過装置の解析

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本研究の目的は、(A)高等動物に於けるミトコンドリア蛋白質前駆体の輸入反応の素過程を明らかにするため、その初期段階である、「細胞質因子によるミトコンドリア蛋白質前駆体の認識並びにミトコンドリア外膜の受容体へのターゲテイング」に注目し、その分子機構を解明すること、並びに、(B)「一過的なミトコンドリアへの局在化」の分子機構を解明するために、蛋白質合成後、ある条件下でミトコンドリアに局在化することが報告されている蛋白質を用いて、その蛋白質のミトコンドリア局在化配列を明らかにし、その「一過的な局在化」に関わる、細胞質因子並びに膜透過装置を解析することである。(A)に関しては、新規のミトコンドリア前駆体タンパク質の外膜受容体であると考えられる、OM37のノックダウン実験と大腸菌発現系、培養細胞発現系の構築を進めている。(B)に関しては、前年度に引き続いて立命館大学の菊池正和教授との共同研究を進めている。PDIファミリーの一員である、P5が、小胞体だけではなくミトコンドリアにも局在していることが示唆されていたが、前年度に得られた知見に加えて、新たに以下の結果を得ることができた。(1)細胞分画を行うと、ほぼ2:3の割合でミトコンドリアと小胞体に局在していた。(2)ミトコンドリアに局在しているP5は、ミトコンドリアにプロテアーゼ処理を行った場合でも消化されなかった。(3)低張処理によって外膜を破砕したミトプラストを遠心にかけると、ほとんどが沈澱に検出されたものの、上清にもわずかながら検出された。(4)プロテアーゼで処理したミトプラストでは、P5はプロテアーゼに耐性を示した。(5)ミトコンドリアを超音波破砕した後超遠心にかけて沈澱と上清に分離したところ、意外にも、P5は、沈澱にも上清にも検出された。また、沈澱をアルカリ処理すると、そのほとんどが上清に回収された。(6)小胞体画分のコンタミネーションを除去するために、パーコール密度勾配遠心によって、さらにミトコンドリアを精製した。この高純度ミトコンドリアに於いても、P5を検出することができた。(7)免疫電顕による観察の結果、少数ながら、ミトコンドリアに金コロイド粒子を確認することができた。以上の結果から、P5は、ミトコンドリアに存在し、マトリクス並びに膜間腔の可溶性タンパク質としてだけではなく、内膜のマトリクス側の表在性膜タンパク質として存在していることが分かった。以上の結果を論文に発表した(Kimura, T. et al., 2008, J. Biochem., in press)。P5は、アミノ末端に分泌型シグナルペプチドと、カルボキシ末端にKDEL配列を含む、典型的な小胞体残留型タンパク質であり、見かけ上明らかなミトコンドリア局在化シグナルは含んでいない。このような特徴をもつタンパク質が小胞体とミトコンドリアに「二極性局在」を示す例は現在までに報告がない。今後も、これらを解明するためより詳細な研究を計画している。