ミトコンドリア蛋白質輸送に関わる細胞質因子並びに膜透過装置の解析

参与线粒体蛋白转运的细胞质因子和膜渗透设备分析

• 批准号: 15770129
• 负责人: 小宮 徹
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Nagahama Institute of Bio-Science and Technology (2004)Kyushu University (2003)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15770129/
• 关键词: ミトコンドリア; 膜透過; 前駆体; 局在化シグナル; 細胞内輸送; タンパク質輸送; 分子シャペロン; TOM

本研究の目的は、高等動物に於けるミトコンドリア蛋白質輸入の輸入反応の素過程を明らかにするため、その初期段階である、「細胞質因子によるミトコンドリア蛋白質前駆体の認識並びにミトコンドリア外膜の受容体へのターゲティング」に注目し、その分子機構を解明することである。これまでに我々は、ミトコンドリア蛋白質前駆体の輸送を担う分子をラット肝臓細胞質より精製し、「ミトコンドリア輸入促進因子(MSF)」と名付けた。前年度の研究の結果、以下の事実を明らかにした。(1)前駆体/MSF複合体を界面活性剤を用いて可溶化したミトコンドリアとインキュベートし、その後免疫共沈をおこなうと、前駆体並びにMSFは新規の外膜因子OM37と共沈したことから、これら三者は複合体を形成することが分かった。(2)意外なことに、この複合体の中には既知の外膜因子であるTom20が含まれていることがわかった。(3)この複合体はATPの共存下で解離した。(4)ATPの存在下でタイムコースを追うと、時間経過に伴って、前駆体分子がTom20/OM37の段階から、膜透過チャネルの主成分である、Tom40に移行することが分かった。今年度は、これらの成果を踏まえて、さらに実験をすすめた結果、以下のことを明らかにした。(1)前駆体/MSF複合体を、大腸菌で発現かつ精製したOM37の細胞質ドメイン(OM37CD)とインキュベートし免疫沈降を行うと、これらは共沈してくることから、これら三者は複合体を形成することが分かった。(2)(1)の複合体は、ATPの共存下で解離した。すなわち、界面活性剤を用いて可溶化したミトコンドリアで得られた結果と同様な結果が、OM37CDを用いた実験でも得られた。以上の結果から、OM37が1前駆体/MSF複合体のミトコンドリア外膜上の受容体として機能している可能性が高いと考えられる。現在、OM37のRNAiを行うための予備実験を進めており、これらの成果を論文にするために準備を行っている。

这项研究的目的是阐明线粒体蛋白在上等动物中进口的进口反应的基本过程，并阐明研究早期阶段的分子机制，“识别细胞质因子对线粒体蛋白前体的认识，并靶向线粒体外膜对受体的靶向。”迄今为止，我们已经纯化的分子负责从大鼠肝细胞质中转运线粒体蛋白前体，并将其命名为“线粒体进口促进因子（MSF）”。上一年的研究结果揭示了以下事实：（1）使用表面活性剂将前体/MSF复合物与溶解的线粒体一起孵育，然后进行共同免疫沉淀，前体和MSF共同取代了新型的外膜OM37，并发现这些组合三组形成了三组。 （2）令人惊讶的是，发现该复合物包含已知的外膜因子TOM20。 （3）在ATP存在的情况下，这种复合物解离。 （4）在ATP存在的情况下追求时间过程时，发现随着时间的流逝，前体分子从TOM20/OM37阶段转变为TOM40，这是膜可渗透通道的主要组成部分。今年，我们进一步实验了这些结果，并揭示了以下内容：（1）当前体/MSF复合物与OM37的细胞质结构域（OM37CD）一起孵育时，在大肠杆菌中表达并纯化，并在大肠杆菌中纯化并进行了免疫沉淀，并将这些组合成三组。 （2）在ATP存在下解离（1）的复合物。也就是说，在实验中使用OM37CD在实验中获得了与使用表面活性剂溶解的线粒体溶解的结果相同的结果。从以上结果来看，OM37可能在1前体/MSF复合物的线粒体外膜上充当受体。我们目前正在进行初步实验，以在OM37上执行RNAi，并准备将这些结果纳入论文中。