アルストロメリアにおける試験管内受精を用いた発生制御機構の解析と遠縁交雑への応用

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アルストロメリアにおいて試験管内受精技術を開発するために、配偶子の単離条件の検討を行った。はじめに、胚珠から卵細胞および接合子の単離条件の検討を行った。卵細胞の単離には、未受粉の子房を供試し、子房を切開して胚珠を摘出し、解剖顕微鏡下でナイフを用いて合点部分を切除した。合点部分を切除した胚珠を酵素処理し、組織を軟化させた後に倒立顕微鏡下でガラス針を用いて解剖を行った。酵素処理前に合点部分を切除することにより効果的に酵素を働かせることができ、ガラス針による解剖を容易にすることができた。先端を鋭く加工したガラス針で合点側から卵細胞を単離する手法により、効率的に雌性配偶子を回収することができた。接合子の単離には、人工受粉した雌ずいを供試した。アニリンブルー染色による花粉管伸長の調査から、受粉24時時間後に80%以上の胚珠で花粉管の珠孔への侵入が見られた。花粉管の珠孔への侵入を受精成立の指標とし、受粉24時間後の雌ずいを供試して接合子の単離を試みた。卵細胞単離と同様の手法を用いて胚珠を調整し、ガラス針による解剖を行ったところ、花粉管とともに接合子を単離することができた。雄性配偶子の単離のために、アルストロメリアが二細胞性の花粉を持つことから、人工培地中で花粉を発芽させ、雄原細胞から精細胞を形成させる手法の開発に取り組んだ。開葯直後の花粉を供試し、高頻度で迅速に花粉発芽し伸長する培地条件の検索を行った。その結果、液体培地中で効率良く花粉発芽する培地を開発し、培養経過時間を追ってDAPI染色により雄原細胞から精細胞を形成するタイミングを調査した。培養18時間以降に精細胞を確認することができ、これらの花粉管を用い、ガラス針による花粉管の切断を行ったところ、花粉管より精細胞のみを単離することができた。以上の研究により、アルストロメリアの試験管内受精技術の基盤を築くことができた。