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アルストロメリアにおける試験管内受精を用いた発生制御機構の解析と遠縁交雑への応用

六出花体外受精发育控制机制分析及其在远缘杂交中的应用

基本信息

批准号：
17780018
负责人：
星野洋一郎
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

アルストロメリアにおいて試験管内受精技術を開発するために、配偶子の単離条件の検討を行った。はじめに、胚珠から卵細胞および接合子の単離条件の検討を行った。卵細胞の単離には、未受粉の子房を供試し、子房を切開して胚珠を摘出し、解剖顕微鏡下でナイフを用いて合点部分を切除した。合点部分を切除した胚珠を酵素処理し、組織を軟化させた後に倒立顕微鏡下でガラス針を用いて解剖を行った。酵素処理前に合点部分を切除することにより効果的に酵素を働かせることができ、ガラス針による解剖を容易にすることができた。先端を鋭く加工したガラス針で合点側から卵細胞を単離する手法により、効率的に雌性配偶子を回収することができた。接合子の単離には、人工受粉した雌ずいを供試した。アニリンブルー染色による花粉管伸長の調査から、受粉24時時間後に80%以上の胚珠で花粉管の珠孔への侵入が見られた。花粉管の珠孔への侵入を受精成立の指標とし、受粉24時間後の雌ずいを供試して接合子の単離を試みた。卵細胞単離と同様の手法を用いて胚珠を調整し、ガラス針による解剖を行ったところ、花粉管とともに接合子を単離することができた。雄性配偶子の単離のために、アルストロメリアが二細胞性の花粉を持つことから、人工培地中で花粉を発芽させ、雄原細胞から精細胞を形成させる手法の開発に取り組んだ。開葯直後の花粉を供試し、高頻度で迅速に花粉発芽し伸長する培地条件の検索を行った。その結果、液体培地中で効率良く花粉発芽する培地を開発し、培養経過時間を追ってDAPI染色により雄原細胞から精細胞を形成するタイミングを調査した。培養18時間以降に精細胞を確認することができ、これらの花粉管を用い、ガラス針による花粉管の切断を行ったところ、花粉管より精細胞のみを単離することができた。以上の研究により、アルストロメリアの試験管内受精技術の基盤を築くことができた。

In vitro fertilization techniques were developed and conditions for mating were discussed. The conditions for the separation of ovules and zygotes are discussed. The ovaries were cut open and the ovules were removed. The ovaries were dissected under microscope. The ovules were removed and the tissues were softened. The enzyme is easy to remove from the tissue. The female partner of the female is the female. The zygote is isolated and artificially pollinated. After 24 hours of pollination, more than 80% of the ovules and micropyle invasion were observed. Invasion of pollen tube into micropyle and establishment of fertilization index, female test after 24 hours of pollination and separation test of zygote The same method can be used to isolate egg cells to adjust ovules, dissect them with needles, and isolate zygotes from pollen tubes and hands. The male mating cells are separated from each other, and the pollen cells are separated from each other. The pollen cells are cultured in artificial culture, and the sperm cells are formed. Pollen germination was tested at a high frequency after pollination, and the conditions for pollen germination and elongation were investigated. As a result, we investigated the development of culture in liquid culture with good efficiency for pollen germination, the formation of androblasts and sperm cells after DAPI staining while tracking the elapsed time of culture. Culture for 18 hours to determine whether the sperm cell is in use, pollen tube is cut, pollen tube is separated, sperm cell is isolated. In the above study, the basic plate of in vitro fertilization technology was established.