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アルストロメリアの遺伝子導入系の確立に関する研究

六出花基因导入体系建立的研究

基本信息

批准号：
12760014
负责人：
星野洋一郎
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

アルストロメリアの植物体再生系を確立するために、葉片及び節間を供試して、植物成長調節物質に対する反応を調査したが、器官形成及びカルス形成ともに認められなかった。一方、胚珠培養を行う過程で、発芽とともにカルスが形成されることを見出し、このカルスをもとに懸濁培養細胞の誘導を試みた。胚珠培養由来のカルスの増殖が緩慢であることから、植物成長調節物質を組み合わせて添加した培地にカルスを置床し、増殖の良い培地条件の検討を行った。その結果、サイトカイニン(BA,TDZ,kinetin)を添加するとカルスは褐変する傾向にあり、1mg/l2,4-Dまたはpicloramを単独で添加した培地でカルスは旺盛な生育を示すことが明らかとなった。懸濁培養細胞からの植物体再生について、0.5mg/lNAAおよび0.5mg/lBAを添加した培地上で最も高頻度で不定芽の再生が観察された。不定芽は同組成の培地上で発根し、植物成長調節物質を含まない1/2MS培地に移植の後、培養を継続すると根茎の形成が観察された。根茎を形成した再生植物体は容易に順化でき、順化後の植物体について培養変異は認められなかった。遺伝子導入系を確立するために、懸濁培養細胞にAgrobacterium tumefaciensの接種を試みたところ、picloramを添加した培地で維持している懸濁培養細胞にA.tumefaciens EHA101(pIG121Hm)を接種した試験区において最も高いGUS発現が見られた。接種を行ったカルスについて、接種1カ月後からhygromycinによる選抜を行ったところ、選抜培地上で生存するカルスが現れた。このカルスについてGUSアッセイを行ったところ、カルス全体が青く染色され、GUS遺伝子の導入が強く示唆された。選抜されたカルスを不定芽再生培地に移植すると、4カ月後から不定芽の再生が確認され、培養を継続すると発根し小植物体に成長した。この小植物体からDNAを抽出し、Polymerase Chain Reaction(PCR)によって導入遺伝子の確認を行った。nptII遺伝子及びGUS遺伝子を増幅するプライマーを用いてPCRを行ったところ、再生植物から抽出したDNAを用いた場合に目的サイズのバンドが確認され、外来遺伝子が導入されていることが示された。

The plant regeneration system was established by testing the effects of plant growth regulators on plant regeneration, organ formation and internode formation. The process of ovule culture, bud development and cell formation were studied. The origin of ovule culture and the growth of ovule are slow. The composition of plant growth regulating substances are mixed. The culture conditions of ovule culture and the growth of ovule are discussed. The results of the study were as follows: BA,TDZ,kinetin, 1 mg/l2, 4-D picloram, 1mg/l2,4 mg/l2,4-D picloram, 1mg/l2, 1 mg/l2, 4,4-D The highest frequency of adventitious bud regeneration was observed in suspension culture with NAA 0.5mg/l and BA 0.5mg/l. Adventitious buds are composed of 1/2MS medium, and root formation is observed after transplanting and culturing. Rootstock formation is easy to regenerate plant body, and the plant body after Hue is cultured is different. A.tumefaciens EHA101(pIG121Hm) was introduced into suspension culture cells and inoculated with A.tumefaciens EHA101(pIG121Hm). Inoculation is carried out in the field, and one month after inoculation, hygromycin is selected and cultivated in the field. The GUS gene is introduced into the cells of the cells. Adventitious bud regeneration was confirmed after 4 months of selection and cultivation, and roots were developed and small plants grew. DNA extraction, Polymerase Chain Reaction(PCR), and identification of introduced DNA NptII gene and GUS gene were amplified by PCR, and the target gene was confirmed by PCR.