新規な炭素-硫黄結合開裂酵素の機能解析と脱硫酵素の分子進化に関する研究

新型碳硫键断裂酶的功能分析及脱硫酶分子进化研究

• 批准号: 17780057
• 负责人: 羽部 浩
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (2006)The University of Tokyo (2005)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17780057/
• 关键词: 硫黄飢餓応答; 有機硫黄化合物代謝; Sulfonatase; Dimethylsulfide; Methanethiol; 硫酸飢餓応答; Dibenzothiophene; Benzylmethylsulfide

細菌は他の微生物と同様その生育に硫黄を必要とするが、通常は最も利用しやすい無機硫酸イオン(SO_42-)を硫黄源とする。しかし自分の周辺環境から自由にSO_42-を摂取できない、「硫酸飢餓」と呼ばれる一種の硫黄欠乏状態に陥ると、その環境に存在する様々な有機化合物を分解して硫黄源とする能力を持っている。土壌中の硫黄元素はその98%が有機物の形で存在しているため、土壌細菌にとってはこの硫酸飢餓応答機構が土壌環境中における重要な生存戦略となる。我々は昨年度、dimethyl sulfide (DMS)を唯一の"硫黄源"として生育可能な土壌細菌Pseudomanas putida DS1株で見出され、DszAやSfnGホモログであるFMN依存性モノオキシゲナーゼSfnA(ただしSfnGとはアミノ酸レベルで30%程度の低い相同性を示す新規な酵素)がmethanthiol(MT)の硫黄代謝に関与していることを明らかにした。そこで本年度は、SfnAの機能解析とともに、硫酸飢餓状態におけるsfnA遺伝子の発現調節機構について解析を行なった。sfnA遺伝子の発現は、新規転写調節因子SfnRの制御下にあると推測されたため、硫酸飢餓状態にあるDS1株およびsfnR破壊株におけるsfnAの発現をRT-PCR解析により調べたところ、予想通りsfnR破壊株では発現していないことが明らかとなり、sfnAの発現がSfnRによって正に制御されていることが示された。またprimer extension法によりsfnAの転写開始点を決定した後、sfnA上流に見出された推定SfnR結合サイトに基づきレポーター解析を行なうことで、sfnAの転写に必要なDNA領域を決定した。さらに推定SfnR結合配列に変異を導入してレポーター解析も行なった。SfnAを大腸菌クローンを用いて生産してmethansulfinateに対する酸化活性を確認したところ、わずかながら活性を示した。

The bacteria and other microorganisms need sulfur for reproduction, and usually use inorganic sulfur (SO_42-). SO_42-free environment, sulfuric acid starvation, sulfur deficiency, and the ability to decompose organic compounds and sulfur sources. Sulfur in soil is 98% of the organic matter in the form of sulfur, sulfur in soil bacteria, sulfur in sulfuric acid, and sulfur in the environment. In the past year, dimethyl sulfide (DMS) was the only "sulfur source" and the only viable bacteria Pseudomonas putida DS1 strain was found, DszA and SfnG were found to be FMN dependent on SfnA(SfnG was found to be 30% identical to SfnA), and methanthiol(MT) was found to be related to sulfur metabolism. This year, SfnA's function analysis and analysis, sulfuric acid starvation state, SfnA's gene generation regulation mechanism analysis and implementation. The expression of sfnA gene was predicted under the control of SfnR gene, and the expression of sfnA gene was predicted under the control of SfnR gene under the condition of sulfuric acid starvation. The primer extension method determines the DNA domain necessary for sfnA to be written. It is estimated that the SfnR combination is different from the original one. SfnA can be used to produce methansulfinate and acidify bacteria.