ステロイド受容体認識配列における遺伝的多様性の分子基盤の構築

1.ステロイド受容体認識配列(SRE)における遺伝的多様性の全ゲノム解析ヒト全ゲノム中に点在するSREにおける変異の有無を検討するため、申請者は以下の実験を行った。○ヒトゲノム全配列中に存在するSREをマッピングし、そのうち遺伝子コード領域内もしくは近傍に位置するものを抽出する。○各SRE特異的プライマーを設計し、PCR-SSCP法により塩基変異の有無を探索する。○塩基変異の存在が推定されたPCR産物の塩基配列を決定し、塩基変異の位置を同定する。PCR-SSCP法により、抽出した各SRE(175箇所)上の変異の有無を探索したところ、3箇所のSRE(TEAD1、NF-IC、NELL1遺伝子内もしくは遺伝子近傍)については実際にSRE中に塩基変異が存在していることを確認した。これらのうち、TEAD1およびNF-ICは転写・シグナル伝達関連因子であり、NELL1は細胞増殖因子であることから、遺伝子発現においてこれらの因子の影響を受ける蛋白は多岐にわたると考えられた。2.各SREにおいて認められた変異が被制御遺伝子の発現に及ぼす影響の検討各変異SREの生理的意義を解明するため、申請者は以下の実験を行った。○子宮頚癌由来HeLa細胞を対象として、各変異SREの近傍に位置する遺伝子におけるステロイド処理時の発現量の変化を、定量的RT-PCR法により検討する。○各変異SREを含む領域および近傍遺伝子の5'-上流領域を含むレポータープラスミドを作成し、ルシフェラーゼアッセイ法によりSREの変異が転写調節に及ぼす影響を検討する。RT-PCR法による検討より、1.において同定した3遺伝子のうちNELL1ではステロイド処理により約46倍の誘導が、NF-ICでは約0,7倍の抑制が認められた。また、ルシフェラーゼアッセイにより各遺伝子変異の転写調節に及ぼす影響を検討したところ、NF-IC遺伝子近傍のSREの変異により、ステロイド処理によるNF-ICの発現抑制能に有意な違いが認められた。一方、NELL1遺伝子近傍のSREの変異は、ステロイド処理によるNELL1の誘導的発現には影響しないことが明らかとなった。

1.ステロイド受容体認識配列(SRE)における遺伝的多様性の全ゲノム解析ヒト全ゲノム中に点在するSREにおける変異の有無を検討するため、申請者は以下の実験を行った。○ヒトゲノム全配列中に存在するSREをマッピングし、そのうち遺伝子コード領域内もしくは近傍に位置するものを抽出する。○各SRE特異的プライマーを設計し、PCR-SSCP法により塩基変異の有無を探索する。○塩基変異の存在が推定されたPCR産物の塩基配列を決定し、塩基変異の位置を同定する。PCR-SSCP法により、抽出した各SRE(175箇所)上の変異の有無を探索したところ、3箇所のSRE(TEAD1、NF-IC、NELL1遺伝子内もしくは遺伝子近傍)については実際にSRE中に塩基変異が存在していることを確認した。これらのうち、TEAD1およびNF-ICは転写・シグナル伝達関連因子であり、NELL1は細胞増殖因子であることから、遺伝子発現においてこれらの因子の影響を受ける蛋白は多岐にわたると考えられた。2.各SREにおいて認められた変異が被制御遺伝子の発現に及ぼす影響の検討各変異SREの生理的意義を解明するため、申請者は以下の実験を行った。○子宮頚癌由来HeLa細胞を対象として、各変異SREの近傍に位置する遺伝子におけるステロイド処理時の発現量の変化を、定量的RT-PCR法により検討する。○各変異SREを含む領域および近傍遺伝子の5'-上流領域を含むレポータープラスミドを作成し、ルシフェラーゼアッセイ法によりSREの変異が転写調節に及ぼす影響を検討する。RT-PCR法による検討より、1.において同定した3遺伝子のうちNELL1ではステロイド処理により約46倍の誘導が、NF-ICでは約0,7倍の抑制が認められた。また、ルシフェラーゼアッセイにより各遺伝子変異の転写調節に及ぼす影響を検討したところ、NF-IC遺伝子近傍のSREの変異により、ステロイド処理によるNF-ICの発現抑制能に有意な違いが認められた。一方、NELL1遺伝子近傍のSREの変異は、ステロイド処理によるNELL1の誘導的発現には影響しないことが明らかとなった。