Dbf4/Cdc7によるS期チェックポイント制御機構の解明

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1.DNA傷害時におけるDbf4/Cdc7のリン酸化の解析(1)DNA傷害によるDbf4のリン酸化とATM/ATRとの関連ATM/ATR過剰発現細胞をもちいてIR(20Gy),UV(50J/m2),HU(1mM,24hrs),etoposide(50μM,24hrs)処理後のDbf4のリン酸化をSDS-PAGEにより解析した。その結果これらのDNA傷害誘導処理とATM/ATRの過剰発現を組み合わせることによりDbf4のリン酸化が増強される可能性を示唆する結果が得られた。(2)ATM/ATRによるDbf4のリン酸化部位の解析Dbf4には7つのATM/ATRによるリン酸化のコンセンサス配列(S/TQ)が存在する。GST融合タンパクを作製し、site-directed mutagenesisによりアラニン変異体を作製しATM/ATRによるリン酸化部位を同定した。その結果、5つのSQ/TQ部位がATM/ATRによるリン酸化の標的である可能性が示唆された。その他の2カ所については継続して解析している。2.Dbf4のリン酸化変異体および抗リン酸化抗体の作製同定した5つのリン酸化部位をアラニン(A ; phospho-negative)またはグルタミン酸(D ; phospho-mimic)に変異させ、表現型解析にもちいるDbf4の全長を含むFlagタグプラスミドを作製した。上記のATM/ATRによるリン酸化部位に対する特異抗体を数種類作製した。このうちN末端付近のSQを認識する抗体を用いてin vivoにおけるDbf4のリン酸化の機能解析を行っている。