Carmalにより制御されるシグナル伝達分子の探索及びシグナル伝達機構の解析

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「研究の目的」Carmalの機能を明らかにするため、 Carmalと相互作用ずるシグナル伝達分子の探索と機能解析を目的として研究を行った。前年度の実績により、Carmalと特異的に相互作用する分子(以下、分子Xと称す)を、酵母ツーハイブリッド法を用いたスクリーニングにより同定した。本年度は、同分子が、Carmalが媒介するシグナル伝達経路に及ぼす影響と、さらにその生理的意義を明らかにすることを目的とし、研究を行った。「本年度の研究成果」1.分子XとCarmalの相互作用のシグナル伝達における役割を解明するため、 Carmalと分子Xの各種欠失/部分変異分子を用いた検討の結果、Carmalと分子Xが物理的に相互作用するために必要な部位を同定した。次に、分子Xとの相互作用に必須のアミノ酸部位に部分変異を導入したCarmalを、 Carmal欠失Jurkat株(JpM50.6)に導入した復帰株を作成し、 T細胞抗原レセプター(TCR)刺激後のNF-kB活性化に及ぼす影響を、NF-kB結合配列をプロモーターに有するLuciferase発現カセットを用いたレポーター解析により解析した。その結果、部分変異を導入したCarmalをトランスフェクトしたJPM50.6は、TCR刺激およびPMA+CD28刺激を介したNF-kB活性化を復帰することが出来なかった。従って、 Carmalと分子Xの相互作用が、TCRを介したNF-kB活性化をポジティブに制御していることが明らかとなった。2.分子XとCarmalの相互作用の生理的意義を解明するため、分子Xとの結合に必須のアミノ酸に点変異を導入したCarmalのノックインマウスの作成を開始した。現在までのところ、相同組み替えにより点変異を持つCarmal分子を片方のアリルに持つES細胞は既に樹立し、そのESクローンから樹立したキメラマウスの作成に成功している。