CDRシャッフリングによる高性能抗ハプテン抗体創製の試みと臨床化学分析への応用

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前年度調製した形質転換大腸菌のライブラリー(3.1x10^7種)にVCSM13ヘルパーファージを感染させ,ファージ粒子上に一本鎖Fvフラグメント(scFv)を提示したファージ抗体ライブラリーを調製した.調製したファージ抗体ライブラリーを,コルチゾール(CS)の3位4位および21位にウシ血清アルブミン(BSA)を結合させた抗原を用いてパンニングを行った.すなわち,各種抗原をそれぞれ固定化したチューブに,ファージ抗体ライブラリーを反応させたのち洗浄し,0.1Mトリエチルアミン溶液を添加して抗原と反応しているファージを回収した.回収したファージは大腸菌に感染させたのち,再度ファージ提示を行い,次のパンニングに利用した.これら一連の操作を3回および4回繰り返して回収されてきたファージ群について,上記抗原に対する結合活性を調べた.すなわち,抗原固定化プレートにファージ抗体を反応させて洗浄したのち,西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ファージ抗体および発色基質を順次反応させ,得られるシグナルを吸光光度法により測定した.その結果,CSの3位および4位BSA結合体(CS-3-BSS,CS-4-BSA)固定化チューブに対して4回パンニングしたファージ群において,対応する抗原との反応性が認められた.そこで,これらファージ群を大腸菌XL1-Blue株へと感染させてクローン分離したのち,再度ファージ提示し,同様に結合活性を調べた.その結果,CS-3-BSAおよびCS-4-BSAに反応性を有するクローンの獲得に成功した.このファージを大腸菌XLOLR株へと感染させて得られる形質転換菌から,scFvタンパク質を調製し,その抗原結合能について調べたところ,先と同様の結合活性が確認できた.しかし,競合法によりCSとの反応性を調べた結果,添加するCS量の増大に伴うシグナルの減弱は認められず,得られたscFvはCSとBSAの複合体を認識している可能性が示唆された.