CDRシャッフリングによる高性能抗ハプテン抗体創製の試みと臨床化学分析への応用

尝试通过CDR改组创建高性能抗半抗原抗体并应用于临床化学分析

• 批准号: 17790361
• 负责人: 加藤 芳徳
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Kobe Pharmaceutical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17790361/
• 关键词: CDRシャッフリング; 抗ハプテン抗体; 臨床化学分析

前年度調製した形質転換大腸菌のライブラリー(3.1x10^7種)にVCSM13ヘルパーファージを感染させ,ファージ粒子上に一本鎖Fvフラグメント(scFv)を提示したファージ抗体ライブラリーを調製した.調製したファージ抗体ライブラリーを,コルチゾール(CS)の3位4位および21位にウシ血清アルブミン(BSA)を結合させた抗原を用いてパンニングを行った.すなわち,各種抗原をそれぞれ固定化したチューブに,ファージ抗体ライブラリーを反応させたのち洗浄し,0.1Mトリエチルアミン溶液を添加して抗原と反応しているファージを回収した.回収したファージは大腸菌に感染させたのち,再度ファージ提示を行い,次のパンニングに利用した.これら一連の操作を3回および4回繰り返して回収されてきたファージ群について,上記抗原に対する結合活性を調べた.すなわち,抗原固定化プレートにファージ抗体を反応させて洗浄したのち,西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ファージ抗体および発色基質を順次反応させ,得られるシグナルを吸光光度法により測定した.その結果,CSの3位および4位BSA結合体(CS-3-BSS,CS-4-BSA)固定化チューブに対して4回パンニングしたファージ群において,対応する抗原との反応性が認められた.そこで,これらファージ群を大腸菌XL1-Blue株へと感染させてクローン分離したのち,再度ファージ提示し,同様に結合活性を調べた.その結果,CS-3-BSAおよびCS-4-BSAに反応性を有するクローンの獲得に成功した.このファージを大腸菌XLOLR株へと感染させて得られる形質転換菌から,scFvタンパク質を調製し,その抗原結合能について調べたところ,先と同様の結合活性が確認できた.しかし,競合法によりCSとの反応性を調べた結果,添加するCS量の増大に伴うシグナルの減弱は認められず,得られたscFvはCSとBSAの複合体を認識している可能性が示唆された.

In the past year, VCSM13 was infected with Escherichia coli (3.1x10^7 species), and a key Fv (scFv) was detected on the particles. Antigen binding activity was determined by modulating the antibody sequence from position 3 to position 4 of CS to position 21 of BSA. All kinds of antigens were immobilized, and the antibody was washed with 0.1M of antigen-containing solution. Back to top of the list of E. coli infections. This sequence of operations is 3 - 4 cycles long and the binding activity of the antigen is modulated. Antigen immobilization, antibody detection, and spectrophotometric determination. As a result,CS-3 and CS-4 BSA conjugates (CS-3-BSS,CS-4-BSA) were immobilized on the 4-mer peptide, and the antigen-binding activity of CS-3 and CS-4 was detected. In addition, E. coli XL1-Blue strain was isolated from E. coli, and the activity of E. coli was modulated. As a result,CS-3-BSA and CS-4-BSA were successfully obtained. The antigen binding activity of E. coli XLOLR strain was confirmed after infection with E. coli XLOLR strain. As a result, the increase in the amount of CS and the decrease in the amount of CS were found to indicate the possibility of recognizing the complex of scFv CS and BSA.

项目成果

抗体工学を基盤とする超高感度ハプテンイムノメトリックアッセイへのアプローチ

基于抗体工程的超灵敏半抗原免疫分析方法

• 发表时间: 2007
• 期刊: YAKUGAKU ZASSHI 127
• 作者: 小林典裕;加藤芳徳;大山浩之;後藤順一
• 通讯作者: 後藤順一

Generation of single-chain Fv fragment for the monitoring of deoxycholic acid residues anchored on endogenous proteins

生成单链 Fv 片段，用于监测锚定于内源蛋白上的脱氧胆酸残基

• 发表时间: 2005
• 期刊: Steroids 70
• 作者: Kobayashi N.;Ohtoyo M.;Wada E.;Kato Y.;Mano N.;Goto J.
• 通讯作者: Goto J.

ハプテンに対する高親和力特異モノクローナル抗体の創製とトレースキャラクタリゼーションへの応用

针对半抗原的高亲和力特异性单克隆抗体的创建及其用于追踪表征的应用

• 发表时间: 2005
• 期刊: 臨床化学 34・2
• 作者: Yuji Makita;Minoru Omura;Setsuko Ando;小林 典裕
• 通讯作者: 小林 典裕

Immunoenzymometric assay for a small molecule, 11-deoxycortisol, with attomole-range sensitivity employing an scFv-enzyme fusion protein ant anti-idiotype antibodies

使用 scFv-酶融合蛋白和抗独特型抗体对小分子 11-脱氧皮质醇进行免疫酶学测定，具有阿托摩尔范围的灵敏度

• 发表时间: 2006
• 期刊: Analytical Chemistry 78・7
• 作者: Norihiro Kobayashi;Keiichi Iwakami;Shuhei Kotoshiba;Toshifumi Niwa;Yoshinori Kato;Nariyasu Mano;Junichi Goto
• 通讯作者: Junichi Goto