RNAiランダムスクリーニング方を用いたp53誘導新規アポトーシス関連因子の検索

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1.p53誘導性アポトーシス・スクリーニングシステムの確立Clontec社tet-onシステムを用いて、内在性p53の欠失したsaos2細胞株にテトラサイクリン(tet)の濃度依存的にp53を過剰発現する細胞(saos2/tet-on-p53)を作成。この細胞はドキシサイクリン(tetアナログ)の添加によりその濃度依存的にp53の過剰発現が誘導、アポトーシスとなる。しかし本研究でのスクリーニングにはtetによる誘導後に生存する細胞はすべて偽陽性として拾われてしまうため、全ての細胞死が誘導されるラインを選別中である。2.レトロウイルスshRNA発現システムの確立RNAiは2本鎖RNA (dsRNA)を細胞内に導入することでそのRNA配列に特異的な発現抑制がかかる手法で、哺乳類細胞へは21ヌクレオチド前後の短いdsRNAを形質導入することで標的遺伝子の発現を抑制できる。近年ではdsRNAの代わりに、プラスミドベクターを用いて2つの相補的配列をとる21ヌクレオチドの配列の間に短い配列をはさんだ1本鎖のRNAを転写させ細胞内で、dsRNAと同様の効果を安定して発揮するベクターが開発されており、本研究ではClontec社のpSIREN-RetroQ vectorを用いた。ランダムライブラリー作成の準備段階として、関連因子として解析が進んでいるBax, Puma, Noxa等に対するベクターをpositive controlとして作成、1,のsaos2/tet-on-p53細胞に導入し、アポトーシス抑制能の解析を試みた。3、ランダムshRNAライブラリーの作成本研究で作成を目指したランダムshRNAライブラリーは21ヌクレオチドをランダムに作成するため理論上4^<21>=4×10^<12>のスクリーニングが可能であるが、まず一次スクリーニングのため少数のライブラリーの作成に取りかかった。