精巣に特異的に発現する卵活性化因子PLCζの遺伝子導入法を用いた機能解析

利用基因转移方法对睾丸中特异表达的卵子激活因子 PLCζ 进行功能分析

• 批准号: 17791083
• 负责人: 窪田 裕樹
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Nagoya City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17791083/
• 关键词: 精巣; 遺伝子導入; エレクトロポーション; エレクトロポレーション; PLC zeta; EYFP

できるだけ効率よく外来遺伝子を発現させるため、蛍光蛋白の末端にミトコンドリアへの移行シグナルを付けたEYFP-mitoベクターを用い、外来遺伝子と蛍光蛋白との融合蛋白発現ベクターを構築した。このベクターを用いる際の遺伝子導入条件を設定するため、マウス精巣にエレクトロポレーション法によりEYFP-mitoベクターを導入して、EYFP蛋白の発現につき検討を行ない、最適な条件を決定しておいた。マウス精巣のcDNAライブラリからクローニングに成功したマウスPLCζ遺伝子をEYFP-mitoベクターにサブクローニングした。このベクターから目的とするPLCζとEYFPとの融合蛋白が正しく発現されることを、大腸菌を用いて蛋白合成を行わせることで確認しておいた。5週齢のICRマウスを用いて、3μg/mlに調整したPLCζ-EYFP-mitoベクター溶液を精巣網から逆行性に注入した後に50V,50msec,8回の電気刺激を行い、一定の期間の後(20日,40日,60日)にEYFP蛋白の発現を観察した。この条件下では精巣上体精子の中に、PLCζとEYFPとの融合蛋白を発現する精子がおおよそ10%の割合で認められた。この精子とマウス卵を用いてIVFを試みたが、融合蛋白発現精子の数が少なかったためか受精にまでは至らなかった。今後、遺伝子導入された精子のみを分別し、IVFを繰り返し卵活性化のメカニズムの解析を試みる予定である。

で き る だ け sharper rate よ く foreign heritage 伝 son を 発 now さ せ る た め, 蛍 light protein の end に ミ ト コ ン ド リ ア へ の transitional シ グ ナ ル を pay け た EYFP - mito ベ ク タ ー を い, exotic heritage 伝 son と 蛍 light protein と の fusion protein 発 now ベ ク タ ー を build し た. こ の ベ ク タ ー を with い る interstate の heritage 伝 import conditions set を す る た め, マ ウ ス fine 巣 に エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン method に よ り EYFP - mito ベ ク タ ー を import し て, EYFP protein の 発 now に つ き 検 line for を な い, the optimum conditions of な を decided し て お い た. マ ウ ス fine 巣 の cDNA ラ イ ブ ラ リ か ら ク ロ ー ニ ン グ に successful し た マ ウ ス PLC zeta heritage 伝 son を EYFP - mito ベ ク タ ー に サ ブ ク ロ ー ニ ン グ し た. こ の ベ ク タ ー か ら purpose と す る PLC zeta と EYFP と が の fusion proteins are し く 発 now さ れ る こ と を, coliform を い て protein synthesis を line わ せ る こ と で confirm し て お い た. 5 weeks 齢 の ICR マ ウ ス を with い て, 3 mu g/ml に adjust し た PLC zeta - EYFP - mito ベ ク タ ー solution を fine 巣 net か ら retrograde に injection し た に after 50 v, 50 msec, 8 の electric line 気 stimulate を い, の period after の (20, 40, 60 days) に EYFP protein の 発 now を 観 examine し た. こ の conditions で は fine 巣 に, PLC in the upper sperm の zeta と EYFP と の fusion protein を 発 now す る sperm が お お よ そ の 10% cut in で recognize め ら れ た. を こ の sperm と マ ウ ス eggs with い て IVF を try み た が, fusion protein 発 now less number of sperm の が な か っ た た め か fertilization に ま で は to ら な か っ た. In the future, but 伝 import さ れ た sperm の み を し respectively, IVF を Qiao り return し eggs activation の メ カ ニ ズ ム の parsing を try み る designated で あ る.

项目成果

Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis.

• DOI: 10.1016/j.fertnstert.2005.12.012
• 发表时间: 2006-04
• 期刊: Fertility and sterility
• 影响因子: 6.7
• 作者: K. Coward;Hiroki Kubota;O. Hibbitt;J. Mcilhinney;K. Kohri;J. Parrington