3次元微小流体ネットワークを用いたバイオアッセイシステムの構築

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本年度は,変異原物質に応答してルシフェラーゼを発現する試験大腸菌株を用いて生物発光オンチップバイオアッセイを試みた。昨年度に確立した分析フォーマットによりマイトマイシンCなどの各種変異原物質に適用したところ,変異原の強さならびに濃度に応じた生物発光をチップ上から一斉に検出することが可能となった。また,大腸菌をチップに固定化した場合の保存安定性について,生物発光強度ならびに応答比の観点から検討を行った。固定化する菌体濃度およびアガロース濃度に関して最適化された条件下で検討した結果,本チップは4℃にて最大16日間保存可能であることが分かった。一方,培地成分をアガロースに添加した場合,試験菌を30日以上保存可能であることが分かった。しかし,本法で利用するホタル生物発光に対して培地成分による強い阻害効果が見られ,発光強度が大きく減少する結果となった。したがって,試験菌株のレポータータンパク質をホタルルシフェラーゼから培地成分による阻害を受けない発光触媒酵素に変換することでより長期問の保存が可能になるものと期待される。生体内での代謝により変異原性を発現する物質(前変異原物質)について本オンチップアッセイにより検出可能か検討した。前変異原物質にはTrp-P-2を用い,代謝活性化には齧歯類の代謝酵素を含むS9画分を使用した。Trp-P-2とS9を予め混合して代謝活性化を行い,試験菌を固定化したチップに導入した結果をFig.に示す。S9で処理したTrp-P-2を導入したチップからのみ発光が見られた。また,発光応答比は2を超え,Trp-P-2濃度に依存する結果が得られた。このことから,本アッセイを前変異原物質に対して適用可能であることが示された。