細胞シート工学による臨床応用へ向けた培養骨膜を利用した骨再生

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歯科口腔外科、整形外科領域において骨量が不足する疾患に遭遇することは珍しくない。これら骨欠損に対する再生医療として注目されているのが、骨髄細胞を採取し培養系で増殖させ骨芽細胞に分化させた後、生分解性の足場に播種して三次元培養して移植する方法である。本研究ではこれら骨髄細胞とは異なる、骨膜細胞を細胞ソースとして活用し骨組織を誘導する方法、すなわち培養骨膜による骨再生を目指して行った。骨膜細胞シートの作製は東京女子医科大学先端生命医科学研究所が世界にさきがけて開発した温度応答性培養皿を活用した。本申請研究は平成15年度から開始し、平成16、17年度に研究課題(課題番号16791262)「細胞シート工学を応用した培養骨膜による硬組織の再生」として科学研究費補助金(若手B)の助成を受けて行ってきた。現在までの実験でラット、ウサギ、イヌの培養骨膜シートの作製に成功しており、回収した培養骨膜シート中に骨芽細胞、線維芽細胞が含まれていることを確認している。またこの培養骨膜シートをラットの頭頂骨に作製した骨欠損モデルに移植したところ、欠損辺縁骨からの骨再生とは異なり、欠損中心部から異所性に再生骨が出現し継時的に増大することも確認できている。本年度はこれまでの結果を踏まえて、より骨形成能の高い培養骨膜を作成するために、培養骨膜シートの生化学的解析を行った。骨形成に関わる蛋白としては1、type I collagen(骨基質中にもっとも多く含まれる蛋白)2、ALP(骨芽細胞の初期の分化マーカー)3、Osteopontin(骨芽細胞の中期の分化マーカー)4、Osteocalcin(骨芽細胞の後期の分化マーカー 5、Runx2(間葉系幹細胞の骨芽細胞の分化に必要な転写因子 などが主にあげられる。骨膜細胞培養時に培養条件をかえることにより、これらの骨形成蛋白の発現にどのような違いがあるかを検討するためにRT-PCR法を用いて実験を行った。結果は作成した培養骨膜中にはこれらすべての骨関連蛋白が含まれていた。次に培養条件を1、通常培地(DMEM)で培養したもの、2、骨形成培地で24時間コンフルエント後培養したもの、3、骨形成培地で72時間コンフルエント後培養したのも、4、骨形成培地で120時間コンフルエント後培養したもの、で比較検討をおこなった。Runx2はすべての条件で均等に発現していた。Type I collagenは1と2の条件下で多く発現していた。ALPは1の条件のみで多く発現していた。Osteopontinは2と3の条件で多く発現していた。Osteocalcinは4の条件のみで多く発現していた。このことから、骨形成培地で培養する時間が長いほど培養骨膜中に含まれる骨芽細胞の分化が進んでいる可能性があることが示唆された。今後はさらにn数を増やし実験を行う予定である。