骨粗鬆症の分子標的治療を目指したTRAF6蛋白質複合体のシグナル識別機構の解析

TRAF6蛋白复合物分子靶向治疗骨质疏松症的信号识别机制分析

• 批准号: 18799010
• 负责人: 松村 隆之
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Waseda University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18799010/
• 关键词: 骨・軟骨代謝学; 骨粗鬆症; 破骨細胞

【目的】骨粗鬆症は破骨細胞の異常な活性化によって引き起こされる。我々は世界に先駆けて、TRAF6が破骨細胞を誘導するRANKシグナルと細菌感染防御に働くTLRシグナルを識別して伝達する必須のシグナル伝達因子であることを明らかにした。本研究課題では、RANKシグナルにおけるTRAF6蛋白質複合体のプロテオミクス解析を行うことでRANK/TRAF6シグナルの分子機構を明らかにし、それを応用した骨粗鬆症治療法の開発を目指している。【進捗状況】RAW264.7細胞にHA-Tag付加K63Ub発現ベクターを導入した安定発現株を樹立し、得られたクローンがRANKシグナルによる破骨細胞への分化や、TLRシグナルによる炎症性サイトカイン産生が正常であることを確認した。抗HA抗体結合磁性ビーズを利用した精製法により、LPS刺激依存的にK63型ユビキチンに結合したTRAF6、NEM0などのシグナル伝達分子の検出に成功し、このユビキチン複合体めプロテオミクス解析を進めている。また、市販のRANKLに匹敵する破骨細胞誘導能を持つGST付加RANKL(GST-RANKL)の大量精製系を確立した。このGST-RANKLを処理したRAW264.7細胞の細胞抽出液をGST pull-downすることによりTRAF6を含む活性化RANK複合体の精製に成功し、この活性化RANK複合体のプロテオミクス解析も進めている。さらに別のアプローチとして、RANKおよびTLRシグナルにおけるチロシンリン酸化タンパク質の違いを調べる目的で、SlLAC法を用いたプロテオミクス解析を行なった。その結果、TLRシグナル特異的なチロシンリン酸化タンパク質の同定に成功し、現在その機能解析を行なっている。この内容についてはBMB2007 第30回分子生物学会年会・第81回日本生化学会大会合同大会で学会発表を行なった。

[Objective] Osteoclast activation in patients with osteoporosis is an important factor in the development of osteoporosis. We are the world's leading expert on osteoclast induction, TRAF6, and pathogenic bacterial defense. This study aims to elucidate the molecular mechanism of RANK/TRAF6 protein complex and its application in the development of therapeutic methods for osteoporosis. [Progress] RAW264.7 cells HA-Tag + K63Ub found stable cells, established osteoclast differentiation, TLR, inflammatory cells, normal cells, TLR, TLR, TLR. Anti-HA antibody binds to magnetic field, purification method, LPS stimulation-dependent K63 type receptor, binding to TRAF6, NEM0, detection of receptor molecule, and analysis of receptor complex. A large number of purification systems have been established for the induction of osteoclasts by GST plus RANKL(GST-RANKL), which is comparable to RANKL in the market. GST-RANKL treatment of RAW264.7 cell extract GST pull-down, purification of TRAF6-containing activated RANK complex, and analysis of activated RANK complex. In addition to the above, the SLLAC method is used to analyze the properties of the products. The results show that the TLR system is unique to the system, and the quality of the system has been determined successfully. BMB2007 30th Annual Meeting of Molecular Biology Society·81st Contract Meeting of Japan Biochemical Society

项目成果

Identification of tyrosine-phosphorylated proteins in LPS-activated macrophagesusing SILAC

使用 SILAC 鉴定 LPS 激活的巨噬细胞中的酪氨酸磷酸化蛋白

• 发表时间: 2007
• 作者: T. Matsumura;M. Oyama;H. Hata;K. Semba;J. Inoue
• 通讯作者: J. Inoue