家族性パーキンソン病責任遺伝子産物LRRK2の機能解析

LRRK2（导致家族性帕金森病的基因产物）的功能分析

• 批准号: 18890053
• 负责人: 伊藤 弦太
• 金额: $ 1.68万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18890053/
• 关键词: パーキンソン病; キナーゼ; GTP結合タンパク質

優性遺伝性パーキンソン病(FPD)の中でも頻度の高いPARK8の病因遺伝子産物LRRK2は、Ras様GTP結合ドメイン(Rocドメイン)、プロテインキナーゼドメインを併せ持つ、約2500アミノ酸からなる蛋白質である。これまでにLRRK2が培養細胞内においでGTP結合依存的にリン酸化を受けることを見出したが、そのリン酸化残基や機能的意義は明らかでなかった。まず、アミノ末端に3xFLAGタグを付加した全長LRRK2を恒常発現するHEK293細胞株を作製し、FLAGタグに対する抗体カラムを用いて全長LRRK2を精製した。精製したLRRK2が自己リン酸化活性ならびに基質(Moesin)リン酸化活性を保持していることを確認した。精製したLRRK2をトリプシンによりSDS-PAGEゲル内において消化し、Fe^<3+>ビーズを用いてリン酸化ペプチドを濃縮したのちにMALDI-TOF質量分析計により解析した。その結果、リン酸化ペプチドは複数検出されたが、いずれのリン酸化残基もLRRドメインのアミノ末端側に局在することが明らかになった。さらにタンデム質量分析により、LRRK2のSer910およびSer973がリン酸化を受けることを明らかにした。また、LRRK2のRocドメインよりC末端側をGST融合タンパク質として培養細胞に発現させると、細胞内において他のキナーゼによるリン酸化を受けないことから、LRRドメインを中心とするN末端側領域がリン酸化部位であることを確認した。これらのリン酸化残基のAlaもしくはAsp置換体の機能解析(GTP結合活性、キナーゼ活性)から、LRRK2活性制御における細胞内リン酸化の役割が明らかになると期待される。

Optimum heritage 伝 sex パ ー キ ン ソ ン disease (FPD) の で も high frequency の い PARK8 の causes heritage 伝 zi chan content LRRK2 は, Ras others in GTP combination made ド メ イ ン (Roc ド メ イ ン), プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼ ド メ イ ン を and せ hold つ, about 2500 ア ミ ノ acid か ら な る protein で あ る. こ れ ま で に LRRK2 が culture cells に お い で GTP combination made dependent に リ ン acidification を by け る こ と を shows し た が, そ の リ ン acidification residues や function meaning は Ming ら か で な か っ た. ま ず, ア ミ ノ end に 3 xflag タ グ を plus し た span LRRK2 を constant 発 now す る HEK293 cell lines を as し, FLAG タ グ に す seaborne る antibody カ ラ ム を with い て span LRRK2 を refined し た. Refined し た LRRK2 が himself リ ン acidification active な ら び に matrix (Moesin) リ ン acidification activity was を し て い る こ と を confirm し た. Refined し た LRRK2 を ト リ プ シ ン に よ り sds-page ゲ ル within に お い て digestion し, Fe ^ < 3 + > ビ ー ズ を with い て リ ン acidification ペ プ チ ド を enrichment し た の ち に MALDI - TOF quality analyzer に よ り parsing し た. そ の results, リ ン acidification ペ プ チ ド は plural 検 out さ れ た が, い ず れ の リ ン acidification residues も LRR ド メ イ ン の ア ミ ノ end side に bureau in す る こ と が Ming ら か に な っ た. さ ら に タ ン デ ム quality analysis に よ り, LRRK2 の Ser910 お よ び Ser973 が リ ン acidification を by け る こ と を Ming ら か に し た. ま た, LRRK2 の Roc ド メ イ ン よ り C terminal side を GST fusion タ ン パ ク qualitative と し て culture cell に 発 now さ せ る と, intracellular に お い て he の キ ナ ー ゼ に よ る リ ン acidification を by け な い こ と か ら, LRR ド メ イ ン を center と す る N terminal side field が リ ン acidification parts で あ る こ と を confirm し た. こ れ ら の リ ン acidification residues の Ala も し く は Asp displacement body の function parsing (GTP binding activity, made キ ナ ー ゼ activity) か ら, called active suppression に お け る intracellular リ ン acidification cut が Ming ら の service か に な る と expect さ れ る.

项目成果

Cytoplasmic localization and proteasomal degradation of N-terminally cleaved form of PINK1

• DOI: 10.1016/j.neulet.2007.10.019
• 发表时间: 2008-01-03
• 期刊: NEUROSCIENCE LETTERS
• 影响因子: 2.5
• 作者: Takatori, Sho;Ito, Genta;Iwatsubo, Takeshi
• 通讯作者: Iwatsubo, Takeshi

Leucine-rich repeat kinase 2 colocalizes with alpha-synuclein in Parkinson's disease, but not tau-containing deposits in tauopathies.

在帕金森病中，富含亮氨酸的重复激酶 2 与 α-突触核蛋白共定位，但在 tau 病中则不与含有 tau 的沉积物共定位。

• DOI: 10.1159/000113708
• 发表时间: 2008
• 期刊: Neuro-degenerative diseases
• 作者: Perry,George;Zhu,Xiongwei;Babar,AsimK;Siedlak,SandraL;Yang,Qiwei;Ito,Genta;Iwatsubo,Takeshi;Smith,MarkA;Chen,ShuG
• 通讯作者: Chen,ShuG

Enhanced accumulation of phosphorylated alpha-synuclein and elevated beta-amyloid 42/40 fatio caused by expression of the presenilin-1 deltaT440 mutant associated with familial Lewy body disease and variant Alzheimer's disease

与家族性路易体病和变异型阿尔茨海默氏病相关的早老素 1 deltaT440 突变体的表达导致磷酸化 α-突触核蛋白积累增加和 β-淀粉样蛋白 42/40 脂肪升高

• 发表时间: 2007
• 期刊: Journal of Neuroscience 27(48)
• 作者: 野村和至;秋下雅弘;中村哲郎.山田優子;小島太郎;大池裕美子;飯島勝矢;荒木厚;江頭正人;大内尉義;武居 明美;武居 明美;Perry G;武居 明美;Takatori S;Kaneko H
• 通讯作者: Kaneko H