改良型cDNAライブラリー法を用いた癌関連抗原の同定と腫瘍免疫療法

使用改进的 cDNA 文库方法鉴定癌症相关抗原和肿瘤免疫治疗

• 批准号: 18890139
• 负责人: 熊丸 渉
• 金额: $ 1.66万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18890139/
• 关键词: 腫瘍免疫療法; CTL; サブトラクション; 癌関連抗原; 腫瘍免疫

腫瘍関連抗原ペプチドで細胞傷害性T細胞(CTL)の誘導を試みたところ、SART-1_<690-698>(22.0%)、SART-2_<93-101>(20.0%)、SART-2_<161-169>(2.9%)、SART-2_<899-907>(14.3%)、SART-3_<109-118>(14.3%)、SART-3_<315-323>(11.4%)、CyB_<84-92>(14.3%)、CyB_<91-99>(0%)、1ck_<208-210>(11.4%)、1ck_<486-494>(17.1%)、1ck_<488-497>(5.7%)、ART4_<13-20>(5.7%)、ART4_<75-84>(20.0%)であった。口腔扁平上皮癌患者のペプチドワクチンには、SART-1_<690-698>、SAR-2_<93-101>、ART4_<75-84>が有用であることが示唆されたが、有用と思われるものでもCTLの誘導が20数%であった。そこでCTLが認識する癌細胞特異的な新規癌抗原を発見する目的で、まず口腔扁平上皮癌細胞株(WK2)を樹立した。HLA(human leukocyte antigen)を一致させテーラーメイド治療が可能となるように同一患者から得られた線維芽細胞と末梢血単核球(PBMC)を実験に用いた。マイトマイシンC処理したWK2とPBMCを共存培養してWK2特異的なCTLを誘導した。WK2特異的なCTLとWK2、線維芽細胞とを共存培養したところWK2のみに細胞障害性を認めた。CTLが認識する癌細胞特異的な新規遺伝子を発見する目的でWK2から抽出したcDNAと同一患者の線維芽細胞から抽出したmRNAをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしなかった癌特異的なcDNAをSubtraction法を用いて分離した。完全長のcDNAを得る目的であらかじめadaptorを付加したプライマーを用い、SMART法でcDNAを合成した。癌特異的なcDNAをLD-PCR法を用いて増幅した。増幅したcDNAを同一患者の線維芽細胞に導入して共存培養したところWK2特異的なCTLによって細胞障害性を認めた、この実験系は癌免疫療法のテーラーメイド治療への応用が可能である。

When attempts were made to induce cytotoxic T cells (CTLs) with tumor-associated antigen peptides, SART-1_<690-698>(22.0%), SART-2_<93-101>(20.0%), SART-2_<161-169>(2.9%), SART-2_<899-907>(14.3%), SART-3_ <109-118>（14.3％），Sart- 3_ <315-323>（11.4％），Cyb_ <84-92>（14.3％），Cyb_ <91-99>（0％），1CK_ <208-210>（11.4％），1CK_ <486-496-496-496-494>（17.496-494>） 1CK_ <488-497>（5.7％），ART4_ <13-20>（5.7％）和ART4_ <75-84>（20.0％）。有人提出SART-1_ <690-698>，SAR-2_ <93-101>和ART4_ <75-84>对口服鳞状细胞癌患者的肽疫苗很有用，但是即使被认为有用的患者也具有诱导CTL的20％。因此，为了发现CTL识别的新型癌细胞特异性癌症抗原，我们首先建立了口服鳞状细胞癌细胞系（WK2）。在实验中使用了从同一患者获得的成纤维细胞和外周血单核细胞（PBMC）与HLA（人类白细胞抗原）匹配，并允许进行TaylorMade治疗。丝裂霉素C处理的WK2和PBMC共同培养以诱导WK2特异性CTL。当WK2特异性CTL与WK2和成纤维细胞共培养时，只发现WK2是细胞毒性的。为了发现CTL识别的新的癌细胞特异性基因，杂交了从WK2中提取的mRNA和同一患者的成纤维细胞，而未杂交的癌症特异性cDNA使用减法方法分离。为了获得全长cDNA，使用底漆合成cDNA，并通过智能方法提前添加适配器。使用LD-PCR扩增癌症特异性cDNA。该实验系统将放大cDNA引入同一患者的成纤维细胞，并通过WK2特异性CTL发现细胞毒性，可用于量身定制的癌症免疫疗法治疗。