DNA合成酵素の分子種特異的阻害物質の探索とケミカルノックアウト解析

寻找 DNA 合成酶的分子物种特异性抑制剂和化学敲除分析

基本信息

批准号：
06J01887
负责人：
栗山磯子
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kobe Gakuin University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06J01887/
关键词：
DNA合成酵素阻害剤 DNAポリメラーゼケミカルノックアウト

项目摘要

これまでに、細胞内に導入するために、Humaninに塩基性ペプチドをつけた物質の化学合成を行い、この塩基性ペプチドをつけたHumaninがより強く阻害することがわかった。マウス線維芽細胞であるNIH3T3細胞を用いてHumaninの細胞毒性試験を行い、実験に使用するHumanin濃度は2μMが適当だと考えられた。DNA損傷を起こしていないNIH3T3細胞へHumaninを加えてからの培養時間、固定方法、浸透の時間等の細かい条件を検討し、最適な条件を見いだした。DNA損傷には紫外線照射が最も効率的で簡便であるが、その種類はA、B、Cの3種類があり、その紫外線によって引き起こされるDNA損傷は異なっている。本研究においては、302nmが有効だと考えられた。細胞に最適な方法でDNA損傷を起こし、Humaninを加えて、DNAポリメラーゼ抗体や複製に関与するタンパク質抗体を用いてその時間的空間的増減を調べた。また、他のDNAポリメラーゼ特異的阻害剤(申請者の研究室で見出したDNAポリメラーゼα特異的阻害剤であるDehydroaltenusinやC12など)と併用することにより、DNAポリメラーゼ分子種のダブル・ノックアウトを行うことで、DNA合成(すなわちDNA複製と修復)に関わるDNAポリメラーゼ分子種の働きを直接的に調べた。DehydroaltenusinとC12は、DNAポリメラーゼδやεを阻害せず、DNAポリメラーゼαのみを阻害するため、複製フォーク停滞につながり、さらにリーディング鎖とラギング鎖合成のアンカップリングを引き起こすと考えられた。実際に、C12が細胞内に取り込まれた後、1本鎖DNAが曝されている証拠であるRPA fociの蓄積を観察した。これらの結果から、C12は哺乳動物細胞の複製フォーク進行における研究のための安定したツールであることが示唆され、同時にDNAポリメラーゼα阻害活性を基にした抗癌剤としての有用性が期待された。

迄今为止，已经进行了与人蛋白相关的碱性肽的化学合成以将其引入细胞，并且发现具有碱性肽的人素受到更严重的抑制。使用NIH3T3细胞，小鼠成纤维细胞对人素进行了测试，并认为2μM被认为适合实验中使用的人素浓度。最佳条件是通过检查培养时间，固定方法和渗透时间之类的详细条件来确定的，将人素添加到没有受到DNA损伤的NIH3T3细胞中。紫外线是DNA损伤最有效，最方便的，但是紫外线射线，A，B和C造成了三种类型的DNA损伤，并且存在不同类型的DNA损伤。在这项研究中，302nm被认为有效。将细胞以最佳方式对DNA损伤进行，并添加Humanin，以研究使用DNA聚合酶抗体和涉及复制的蛋白质抗体的时间和空间增加和减少。 Furthermore, by using it in conjunction with other DNA polymerase-specific inhibitors (such as Dehydroaltenusin and C12, which are DNA polymerase α-specific inhibitors found in the applicant's laboratory), we directly investigated the function of DNA polymerase molecular species involved in DNA synthesis (i.e. DNA replication and repair) by double knocking out of DNA聚合酶分子物种。脱氢阿尔替辛和C12不抑制DNA聚合酶δ或ε，而仅抑制DNA聚合酶α，从而导致复制叉停滞，并进一步诱导铅和滞后链的链条合成。实际上，我们观察到RPA灶的积累，这是在细胞中接受C12后单链DNA暴露的证据。这些结果表明，C12是研究哺乳动物细胞复制叉进展的稳定工具，与此同时，根据其DNA聚合酶α抑制性活性，它有望作为抗癌剂有用。