DNA合成酵素の分子種特異的阻害物質の探索とケミカルノックアウト解析

寻找 DNA 合成酶的分子物种特异性抑制剂和化学敲除分析

• 批准号: 06J01887
• 负责人: 栗山 磯子
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Kobe Gakuin University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06J01887/
• 关键词: DNA合成酵素; 阻害剤; DNAポリメラーゼ; ケミカルノックアウト

これまでに、細胞内に導入するために、Humaninに塩基性ペプチドをつけた物質の化学合成を行い、この塩基性ペプチドをつけたHumaninがより強く阻害することがわかった。マウス線維芽細胞であるNIH3T3細胞を用いてHumaninの細胞毒性試験を行い、実験に使用するHumanin濃度は2μMが適当だと考えられた。DNA損傷を起こしていないNIH3T3細胞へHumaninを加えてからの培養時間、固定方法、浸透の時間等の細かい条件を検討し、最適な条件を見いだした。DNA損傷には紫外線照射が最も効率的で簡便であるが、その種類はA、B、Cの3種類があり、その紫外線によって引き起こされるDNA損傷は異なっている。本研究においては、302nmが有効だと考えられた。細胞に最適な方法でDNA損傷を起こし、Humaninを加えて、DNAポリメラーゼ抗体や複製に関与するタンパク質抗体を用いてその時間的空間的増減を調べた。また、他のDNAポリメラーゼ特異的阻害剤(申請者の研究室で見出したDNAポリメラーゼα特異的阻害剤であるDehydroaltenusinやC12など)と併用することにより、DNAポリメラーゼ分子種のダブル・ノックアウトを行うことで、DNA合成(すなわちDNA複製と修復)に関わるDNAポリメラーゼ分子種の働きを直接的に調べた。DehydroaltenusinとC12は、DNAポリメラーゼδやεを阻害せず、DNAポリメラーゼαのみを阻害するため、複製フォーク停滞につながり、さらにリーディング鎖とラギング鎖合成のアンカップリングを引き起こすと考えられた。実際に、C12が細胞内に取り込まれた後、1本鎖DNAが曝されている証拠であるRPA fociの蓄積を観察した。これらの結果から、C12は哺乳動物細胞の複製フォーク進行における研究のための安定したツールであることが示唆され、同時にDNAポリメラーゼα阻害活性を基にした抗癌剤としての有用性が期待された。

こ れ ま で に, intracellular に import す る た め に, Humanin に salt basic ペ プ チ ド を つ け た material の chemical synthesis を い, こ の salt basic ペ プ チ ド を つ け た Humanin が よ り く strong resistance against す る こ と が わ か っ た. マ ウ ス line d bud cells で あ る を NIH3T3 cells with い て Humanin の cytotoxicity test を い, be 験 に use す る Humanin concentration は 2 microns が appropriate だ と exam え ら れ た. DNA damage を up こ し て い な い NIH3T3 cells へ Humanin を plus え て か ら の training time, fixed method, soak の の such as fine か い conditions を beg し, the optimum conditions of な 検 を see い だ し た. DNA damage に は ultraviolet irradiation が most も working rate of simple で で あ る が, そ の kinds は A, B, C 3 kinds が の あ り, そ の ultraviolet に よ っ て lead き up こ さ れ る DNA damage は different な っ て い る. In this study, にお にお て だと and 302nmが are effective for だと examination えられた. DNA damage cells に optimum な method で を up こ し, Humanin を plus え て, DNA ポ リ メ ラ ー ゼ antibody や copy に masato and す る タ ン パ ク quality antibody を い て そ の time space rights reduce を adjustable べ た. ま た, he の DNA ポ リ メ ラ ー ゼ specific resistance against one (see the applicants の laboratory で し た DNA ポ リ メ ラ ー ゼ alpha specific resistance against tonic で あ る Dehydroaltenusin や C12 な ど) と and す る こ と に よ り, DNA ポ リ メ ラ ー ゼ molecules of の ダ ブ ル · ノ ッ ク ア ウ ト を line う こ と で, DNA Into (す な わ ち DNA replication と repair) に masato わ る DNA ポ リ メ ラ ー ゼ molecules of の 働 き を direct に adjustable べ た. Dehydroaltenusin と C12 は, DNA ポ リ メ ラ ー ゼ delta や epsilon を resistance against せ ず, DNA ポ リ メ ラ ー ゼ alpha の み を resistance against す る た め, duplicate フ ォ ー ク stagnation に つ な が り, さ ら に リ ー デ ィ ン グ lock と ラ ギ ン グ lock synthetic の ア ン カ ッ プ リ ン グ を lead き up こ す と exam え ら れ た. Be interstate に, C12 が intracellular に take り 込 ま れ た, this lock DNA が after exposure さ れ て い る card 拠 で あ る RPA foci の accumulation を 観 examine し た. こ れ ら の results か ら, C12 は mammalian cells の copy フ ォ ー ク for に お け る research の た め の settle し た ツ ー ル で あ る こ と が in stopping さ れ, at the same time に DNA ポ リ メ ラ ー ゼ alpha resistance against active を base に し た anti-cancer tonic と し て の usefulness が expect さ れ た.

项目成果

Diallyl sulfides : Selective inhibitors of family X DNA polymerases from garlic (Allium sativum)

二烯丙基硫醚：大蒜（Allium sativum）中 X 家族 DNA 聚合酶的选择性抑制剂

• 发表时间: 2008
• 期刊: Food Chem 108
• 作者: M. Nishida;et.al.
• 通讯作者: et.al.

Inhibitory effect of coenzyme Q on eukaryotic DNA polymerase gamma and DNA topoisomerase II activities on the growth of a human cancer cell line

辅酶 Q 对真核 DNA 聚合酶 γ 和 DNA 拓扑异构酶 II 活性的抑制作用对人癌细胞系生长的影响

• 发表时间: 2006
• 期刊: Cancer Sci 97
• 作者: Yonezawa;Y. et al.
• 通讯作者: Y. et al.

コレステロール誘導体のDNA代謝系酵素・転写因子DREFの阻害活性とヒト癌細胞増殖抑制活性

DNA代谢系统酶/转录因子DREF的抑制活性和胆固醇衍生物的人癌细胞生长抑制活性

• 发表时间: 2007
• 作者: ○石丸千里;栗山磯子;米澤裕子;水品善之;吉田弘美
• 通讯作者: 吉田弘美

リン脂質によるDNA代謝系酵素阻害活性

磷脂对 DNA 代谢酶的抑制活性

• 发表时间: 2007
• 作者: ○石丸千里;米澤裕子;栗山磯子;水品善之;吉田弘美
• 通讯作者: 吉田弘美

The specific inhibitory effect of demethoxydehydroaltenusin, a derivative of dehydroaltenusin, on mammalian DNA polymerase alpha.

脱氢altenusin（脱氢altenusin 的衍生物）对哺乳动物DNA 聚合酶α 的特异性抑制作用。

• 发表时间: 2008
• 期刊: Int J Mol Med 22(6)
• 作者: Kuriyama I;Fukudome K;Kamisuki S;Kuramochi K;Tsubaki K;Sakaguchi K;Sugawara F;Yoshida H;Mizushina Y.
• 通讯作者: Mizushina Y.