細胞遊走活性を有する新規生理活性物質とその受容体の探索

Lipid Yの構造を同定するため、前年度に引き続いてまずはlipid YをHPLCで精製することを試みた。Lipid Yを分泌するHT29細胞の培養上清をHPLCで分画しMSなどの検出器により構造を同定しようと考え、まずはHPLCにかける条件を決める目的で簡便な固相抽出カラム(ODS)を用いた逆相分画を試してみてLipid Yがどのような画分にくるか、すなわちどの画分にA2058遊走活性が見られるかを検討した。その結果、Lipid Yは中性脂質であるというこれまでの結果を裏付けるように、ODSカラムではアセトニトリル濃度が80%以上のフラクションに対しA2058細胞は遊走すること、すなわちLipid Yが溶出することが分かった。実際に培養上清抽出脂質をC18カラムにローディングしHPLCで分画したところ、アセトニトリルのグラシエンド(50%-100%)中にはLipid Yは溶出されず、活性はアセトニトリル100%のwash画分に検出された。この活性画分に含まれる物質のピークの検出をUVまたは蒸発光散乱検出計で試みたが、wash画分には全くピークは見られなかった。また、この活性画分を、細胞遊走活性のないA2058細胞の培養上清から抽出した脂質を同様にHPLCにかけて得られた画分と比較した(HPLC,MS)が、大きな違いを見いだすことはできなかった。おそらく培養上清中に含まれるLipid Yはとても微量であり、HPLCで精製する際には多量の培養上清から抽出した脂質を持ち込む必要があると考えられる。Lipid Yの受容体を同定するために既知のケモカイン・脂質メディエーター受容体を中心にスクリーニングを続行したが、残念ながらめぼしい受容体は引っかかってこなかった。GPCRスクリーニングの系に関しては、G16よりもGiに強いGq-GiのキメラGタンパク質を用いた系を導入するなどの工夫が必要である。

Lipid Yの構造を同定するため、前年度に引き続いてまずはlipid YをHPLCで精製することを試みた。Lipid Yを分泌するHT29細胞の培養上清をHPLCで分画しMSなどの検出器により構造を同定しようと考え、まずはHPLCにかける条件を決める目的で簡便な固相抽出カラム(ODS)を用いた逆相分画を試してみてLipid Yがどのような画分にくるか、すなわちどの画分にA2058遊走活性が見られるかを検討した。その結果、Lipid Yは中性脂質であるというこれまでの結果を裏付けるように、ODSカラムではアセトニトリル濃度が80%以上のフラクションに対しA2058細胞は遊走すること、すなわちLipid Yが溶出することが分かった。実際に培養上清抽出脂質をC18カラムにローディングしHPLCで分画したところ、アセトニトリルのグラシエンド(50%-100%)中にはLipid Yは溶出されず、活性はアセトニトリル100%のwash画分に検出された。この活性画分に含まれる物質のピークの検出をUVまたは蒸発光散乱検出計で試みたが、wash画分には全くピークは見られなかった。また、この活性画分を、細胞遊走活性のないA2058細胞の培養上清から抽出した脂質を同様にHPLCにかけて得られた画分と比較した(HPLC,MS)が、大きな違いを見いだすことはできなかった。おそらく培養上清中に含まれるLipid Yはとても微量であり、HPLCで精製する際には多量の培養上清から抽出した脂質を持ち込む必要があると考えられる。Lipid Yの受容体を同定するために既知のケモカイン・脂質メディエーター受容体を中心にスクリーニングを続行したが、残念ながらめぼしい受容体は引っかかってこなかった。GPCRスクリーニングの系に関しては、G16よりもGiに強いGq-GiのキメラGタンパク質を用いた系を導入するなどの工夫が必要である。