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幅広いタンパク質に適用可能な分子構造イメージング技術の開発

开发适用于多种蛋白质的分子结构成像技术

基本信息

批准号：
18770144
负责人：
松浦徹
金额：
$ 2.3万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の平成19年度の目標は汎用型FRETプローブ(TdFRET-tag)を用いて、様々なFRETセンサーを作成し、その有用性を実証することである。センサーの作製に用いた蛋白質は、IP3受容体のリガンド結合部位、カルシウム結合蛋白質・Calmodulin、Calmodulinとその結合部位M13の融合蛋白質、M13、IP3-3kinase、IP3-5phosphatase、スモールG蛋白質・ARF6、ホヤの電位依存性脱リン酸化酵素・ciVSP、分泌小胞輸送に関わるSynaptotagminに対する一本鎖抗体、以上の9つの蛋白質にTdFRET-tagを遺伝子上で融合し、培養細胞に発現させて、それぞれの蛋白質の活性化に合わせたFRET変化が起こるかどうかを確認した。その結果、IP3-3kinase、IP3-5phosphataseの2つはFRET変化を示さなかったが、たの蛋白質ではFRET変化を観測することができた。特にM13と融合させた場合には、COS-7細胞を10μMのATP刺激した際の細胞内のカルシウム濃度変化に伴い、蛍光顕微鏡上で36±8%のFRET変化を観測した。これは細胞内のカルシウムと結合したCalmodulinとの結合により引き起こされるため、カルシウム-Calmodulinセンサーとして研究に用いることが可能である。このように本研究で開発したセンサーは、万能ではないが、幅広いタンパク質に適用可能なFRETセンサーであることを実証し、またそれを用いて実用レベルのバイオセンサーを開発することにも成功した。

The target of this research in FY2019 is general-purpose FRET tag (TdFRET-tag)をUse いて, 様々なFRETセンサーをmade し, その usefulness を実证することである.センサーの用いたproteinは, IP3 receptor binding site, カルシウム binding protein・Calmodulin, Calmodulinとそのbinding site M13 fusion protein, M13, IP3-3kinase, IP3-5phosphatase, スモールG protein・ARF6, ホヤのPotential-dependent dehydration enzyme・ciVSP, secretory cell transport に关わるSynaptotagmin に対する一 lock antibody, の9つのprotein にTd above FRET-tag is used for fusion, cultured cells, and protein activation. FRET change is confirmed.そのRESULTS, IP3-3kinase, IP3-5phosphataseの2つはFRET剉化をshowさなかったが,たのproteinではFRET剉化を観measureすることができた. Special M13 and fusion conditions, COS-7 cells and 10μM ATP stimulated cells The concentration change of the internal fluorocarbon was carried out, and the FRET change of 36±8% was measured on the optical microscope. Calmodulin inside the cellため、カルシウム-Calmodulinセンサーとして Research に Use いることがpossible である.このようにThis research is applicable to で开発したセンサーは, almighty ではないが, and width 広いタンパクquality なFRET ンサーであることを実证し、またそれを用いて実用レベルのバイオセンサーを开発することにも成した.