トマトにおける細胞壁分解酵素の基質特異性と発現・機能解析

果実細胞壁の構造変化によって、その果実に特有の肉質を形成し、さらに、成熟・過熟時における進行は著しい品質の低下をもたらす。多数の細胞壁代謝酵素のうち、アラビノースの遊離に働くことが推定されるα-アラビノフラノシダーゼについて、特にglycoside hydrolase family 3に分類される本酵素について、クローニングと発現解析、リコンビナントタンパクを利用した基質特異性の検討、および、機能解析のための形質転換体の作成を行うことにより、園芸作物(トマト)における本酵素の役割を明らかにすることを目的とした。1.トマト果実からglycoside hydrolase family 3に分類されるα-アラビノフラノシダーゼをクローニングし、全長塩基配列を決定した。4種のクローンが得られ、それらの発現パターンは、発現ステージならびに発現部位が各々で異なっていた。したがって、トマトの生長や成熟の様々なステージでglycoside hydrolase family 3に分類されるα-アラビノフラノシダーゼが作用していることが推定された。2.得られた遺伝子について、異種細胞系を用いたタンパク発現システムを構築した。大腸菌をホストとした形質転換では活性を有する形でのタンパク質合成は起こらなかった。植物系培養細胞に導入したところ、4種のクローンのうち3種類ではα-アラビノフラノシダーゼ及びβ-キシロシダーゼ活性の2つを有する2機能性の酵素であることが確認された。1種類のクローンについては、人工基質への反応がみられず、α-アラビノフラノシダーゼ及びβ-キシロシダーゼの定義はできなかった。3.トマトに本酵素遺伝子のアンチセンス遺伝子を導入した組み換え体のトマトを作出した。

果実細胞壁の構造変化によって、その果実に特有の肉質を形成し、さらに、成熟・過熟時における進行は著しい品質の低下をもたらす。多数の細胞壁代謝酵素のうち、アラビノースの遊離に働くことが推定されるα-アラビノフラノシダーゼについて、特にglycoside hydrolase family 3に分類される本酵素について、クローニングと発現解析、リコンビナントタンパクを利用した基質特異性の検討、および、機能解析のための形質転換体の作成を行うことにより、園芸作物(トマト)における本酵素の役割を明らかにすることを目的とした。1.トマト果実からglycoside hydrolase family 3に分類されるα-アラビノフラノシダーゼをクローニングし、全長塩基配列を決定した。4種のクローンが得られ、それらの発現パターンは、発現ステージならびに発現部位が各々で異なっていた。したがって、トマトの生長や成熟の様々なステージでglycoside hydrolase family 3に分類されるα-アラビノフラノシダーゼが作用していることが推定された。2.得られた遺伝子について、異種細胞系を用いたタンパク発現システムを構築した。大腸菌をホストとした形質転換では活性を有する形でのタンパク質合成は起こらなかった。植物系培養細胞に導入したところ、4種のクローンのうち3種類ではα-アラビノフラノシダーゼ及びβ-キシロシダーゼ活性の2つを有する2機能性の酵素であることが確認された。1種類のクローンについては、人工基質への反応がみられず、α-アラビノフラノシダーゼ及びβ-キシロシダーゼの定義はできなかった。3.トマトに本酵素遺伝子のアンチセンス遺伝子を導入した組み換え体のトマトを作出した。