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大腸菌で生産される超好熱菌由来グルタミン酸脱水素酵素の活性化の分子機構の解明

阐明大肠杆菌产生的超嗜热菌谷氨酸脱氢酶激活的分子机制

基本信息

批准号：
18780075
负责人：
郷田秀一郎
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Nagasaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18780075/
关键词：
酵素反応生物物理酵素蛋白質微生物

项目摘要

研究代表者は超好熱菌Pyrobaculum islandicum由来グルタミン酸脱水素酵素(GDH)がリコンビナントタンパク質として大腸菌を宿主に用いて生産されると不活性な形(不活性型酵素)で生産され、熱または常温での5M尿素溶液中で天然由来の同酵素と同等の活性を有するまで活性化されること、酵素活性を有するには正しい4次構造形成が必要であることを見出している。昨年度の成果より、不活性型酵素は疎水性残基が表面に露出し、プロテアーゼ消化によるアミノ酸配列解析は172位のPhe付近が表面に露出していることを明らかとした。本年度は、上記の結果を踏まえ、GDHが大腸菌体内で不活性型として生産される原因を解明するため、シャペロンに着目し研究を行った。シャペロンには好熱菌肪Thermococcus sp. KS-1由来FKBPの2種で、プロリン異性化酵素活性を持つものと持たないものを用いた。精製後のGDHに、それらシャペロンを加えても酵素活性に変化は見られなかった。そこで、それらシャペロンを大腸菌体内でGDHと共発現させた結果、プロリン異性化酵素活性を有するものでは大腸菌体内での生産にもかかわらず、酵素活性の上昇が見られた。このことからプロリンの異性化が活性に影響を与えていると考え、172位近傍のプロリンをアラニンに置換し、それらの大腸菌体内で生産させた際の酵素活性を測定した。その結果、142,144位のプロリンをアラニンに置換した変異体は酵素活性が上昇した。これらのことよりGDHの大腸菌体内での不活性型としての生産は、プロリン残基の異性化が正しく起こらず、その結果、誤ったフォールディングを導くことが原因と考えられた。

The research representative showed that the enzyme GDH was produced by the super-good bacterium Pyrobaculum islanicum in the form of an inactive enzyme in the host. The enzyme was produced by heat in a 5M urea solution at room temperature. The activity of the enzyme was equivalent to that of the enzyme. The enzyme activity is necessary for the formation of four structures. The results of the previous year showed that the inactive enzyme was exposed to the surface of the protein, and the acid sequence of the protein was exposed to the surface of the protein. This year, we will study the causes of inactivation in Escherichia coli. KS-1 is derived from two kinds of FKBP, and its heteroenzyme activity is maintained in the middle of the cell. After purification, the enzyme activity was increased. The results of GDH co-production in E. coli and the increase of enzyme activity in E. coli are as follows: The activity of enzyme in Escherichia coli was determined by the method of enzyme substitution near position 172. As a result, the activity of alloenzymes increased at positions 142 and 144. The reason for the inactivation of GDH residues in Escherichia coli is due to the fact that it is not active.