サリン等の神経ガスの新規ターゲット酵素の探索に関する研究

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本年度は、新規神経ガスターゲット酵素の探索のための神経ガス付加物の特異的検出法の開発を目的とし、神経ガス付加セリン残基を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体作製のための神経ガス付加(結合)セリン誘導体の合成を試みた。三塩化リンを出発物質として、モノホスホロアミダイトアルキルエステルをアルキルメチルホスホン酸骨格形成の原料として利用し、これをFmoc-セリンを出発原料として合成した保護セリン(Fmoc-Ser-OPac)と結合させることにより神経ガス付加セリンを合成するとともに、これを原料としてペプチド合成機によるペプチド鎖の伸長を行って目的物を得る合成ルートを計画した。Fmoc-セリン-OPacはFmoc-Ser-OHを原料とし、DCHA塩を経由する合成法により合成を行った。また、リン酸骨格の合成については、当初、ジクロロメチルホスフィンが市販品として入手可能と考えて実験計画を作成したが、輸入不可とのことで三塩化リンからの合成経路を検討した。その結果、十分なジクロロメチルホスフィンを得ることができず、合成方法を再検討する必要があると考えられた。そこで、入手可能な精製セリン酵素類に神経ガスを加えてセリン-神経ガス付加物を形成し、適切な酵素により消化し、HPLCによって精製することにより神経ガス結合セリン残基を含むペプチド断片を作成することを検討した。トリプシンに有機リン系化合物であるDFPを加えてすべての活性セリン残基にDFPを付加した後、還元アルキル化の後、トリプシン消化を行なった。消化物について、4.6mm径のC18逆相カラムを用いてHPLC分析を行ない、分画を取った上で、各画分にっいてLC-MS/MS分析を行ってDFP付加ペプチドの検出を行ない、目的ペプチドの精製を試みた。その結果、目的ペプチドの含有はLC-MS分析で確認されたものの、それ以外のペプチドと分離できず、純粋なDFP付加ペプチドを精製するのは困難であると考えられた。