ヒト起源プロバイオティクスの腸管付着性機構の解明とその応用に関する研究

人源益生菌肠黏附机制的阐明及其应用研究

• 批准号: 07J02318
• 负责人: 木下 英樹
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J02318/
• 关键词: 乳酸菌; プロバイオティクス; 腸管付着性; グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素; GAPDH; 血液型抗原; BIACORE; 付着因子; 付着; ABO式血液型抗原; ヒト大腸ムチン; 癌; 腸管; 糖鎖

乳酸菌の有効利用のためには腸管付着メカニズムの解明が非常に重要である。これまでにヒト大腸ムチンに対し高い付着性を有するLactobacillus plantarum LA318株の付着因子グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)がABO式血液型抗原に高い付着性を示すことを明らかにした。また、GAPDH側の糖鎖認識部位を明らかにするため、NAD^+による阻害試験を行った結果、N-末端側のNAD結合ドメインが結合に関与しているのではないかと考えられた。そこで本年度では、結合部位を明らかにするためGAPDHの(1)全体、(2)N-末端側のみ、(3)C-末端側のみ、(4)C-末端側の一部欠損の4つのリコンビナント体の発現を試みた。目的のDNA断片をEscherichia coli BL-21に組み込み、トランスフォーメーションを行った。PCRにて目的断片DNAの挿入を確認後、IPTGにより発現誘導をかけ37℃、5時間培養を行ったところ、目的の位置に発現タンパク質と思われるバンドを確認できた。さらに、Ni-NTAを用いたWestern blottingによりリコンビナントタンパク質の存在を確認できた。次にリコンビナントタンパク質の発現の条件検討を行ったところ、100mM IPTG 10μL添加、37℃、5時間、200rpmでの培養が適当であると判断した。リコンビナントタンパク質は全て8M尿素画分で検出されたことから封入体を形成していると考えられた。そこで封入体画分からのHisTrap HPカラムを用いてリコンビナントタンパク質の精製を行った。今後、これらの精製リコンビナントタンパク質の酵素活性を指標としたリフォールディング確認を用い、HCMや血液型抗原に対する結合を解析し、大まかな結合部位を決定する。さらにアミノ酸置換などを行い、詳細な結合部位を特定する予定である。

Lactic acid bacteria are very に important である for the effective utilization of <s:1> ために ために in the intestinal tract and メカニズム in the explanation of が. こ れ ま で に ヒ ト e. ム チ ン に し high い pay the seaborne を have す る Lactobacillus plantarum LA318 strains の pay the factor グ リ セ ル ア ル デ ヒ ド - 3 - リ ン acid dehydration vegetable enzyme (GAPDH) が ABO blood type antigen に type high い pay the を shown す こ と を Ming ら か に し た. ま た and GAPDH の sugar lock side know を Ming ら か に す る た め, NAD ^ + に よ る resistance against test line を っ た results, N - terminal side の NAD combining ド メ イ ン が combining に masato and し て い る の で は な い か と exam え ら れ た. そ こ で this year で は, combining site を Ming ら か に す る た め GAPDH の all (1), (2) N - terminal side の み, (3) C - end side の み, (4) C - end side の a owe loss の 4 つ の リ コ ン ビ ナ ン ト body の 発 を now try み た. Objective の DNA fragment を Escherichia coli BL - 21 に group み 込 み, ト ラ ン ス フ ォ ー メ ー シ ョ ン を line っ た. PCR に て purpose fragment DNA の scions into を confirmed, IPTG に よ り 発 now induced を か け line 37 ℃, 5 time cultivating を っ た と こ ろ position, purpose の に 発 now タ ン パ ク qualitative と think わ れ る バ ン ド を confirm で き た. さ ら に, Ni - NTA を with い た Western blotting に よ り リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク qualitative の exist を confirm で き た. Time に リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク qualitative の 発 の conditions now beg を 検 line っ た と こ ろ, 100 mm 10 mu L add IPTG, 37 ℃, 5 hours, 200 RPM で の cultivate が appropriate で あ る と judgment し た. リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク qualitative は て 8 m urea draw points で 検 out さ れ た こ と か ら を seal in body formation し て い る と exam え ら れ た. Body painting points sealed そ こ で か ら の HisTrap HP カ ラ ム を with い て リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク mass line の refined を っ た. In the future, こ れ ら の refined リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク qualitative indicator を の enzyme activity と し た リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ confirm を い, HCM や blood type antigen に す seaborne る combining analytical し を, big ま か な combining site を decided す る. Youdaoplaceholder0 ノ acid displacement な <s:1> を を line さらにア, detailed な binding site を specific する given である.

项目成果

Discavary of new probiotic lacic acid bacteria (LAB) with specific adhesion to human blood ABO type antigen of intestinal mucosa and their application

特异性粘附人血肠粘膜ABO型抗原的新型益生菌乳酸菌（LAB）的发现及其应用

• 发表时间: 2007
• 作者: ○T. Saito;N. Wakahara;H. Kinoshita;H. Matsuo;Y. Kawai;H. Kitazawa;K. Miura;A. Horii;H. Uchida;K. Kimura;N. Taketomo
• 通讯作者: N. Taketomo

乳酸菌表層グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素 (GAPDH)はヒトABO式血液型抗原構造を認識する!一乳酸菌のヒト腸管定着性機構の一部を解明-

乳酸菌表面3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）可识别人类ABO血型抗原结构！乳酸菌定植人体肠道的部分机制已被阐明。

• 发表时间: 2008
• 作者: 木下英樹;ら
• 通讯作者: ら

抗生物質代替品として有望なブタ腸管付着性新規プロバイオティック乳酸菌の探索

寻找粘附在猪肠道上的新型益生菌乳酸菌作为有前途的抗生素替代品

• 发表时间: 2007
• 作者: ○川崎保美;木下英樹;川井泰;北澤春樹;上野啓介;小林一彦;齋藤忠夫
• 通讯作者: 齋藤忠夫

総説「プロバイオティック乳酸菌の血液型抗原を介したヒト腸管付着性機構

综述文章《益生菌乳酸菌血型抗原介导的人体肠粘连机制》

• 发表时间: 2008
• 期刊: 日本乳酸菌学会誌 19
• 作者: 木下英樹;渡辺真通;齋藤忠夫
• 通讯作者: 齋藤忠夫

ブタ腸管付着性新規プロバイオティクスの探索と抗生物質低減飼料への利用(その2)

寻找可粘附在猪肠道上的新型益生菌并用于减抗生素饲料（第 2 部分）

• 发表时间: 2008
• 作者: ○齋藤忠夫;川崎保美;木下英樹;若原望美;渡辺真通;川井泰;北澤春樹;上野啓介;小林一彦
• 通讯作者: 小林一彦