超分子ナノマシン細菌べん毛モーターを再構成して機能を探る

超分子纳米机器重建细菌鞭毛马达并探索其功能

基本信息

批准号：
07J02549
负责人：
檜作洋平
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J02549/
关键词：
大腸菌べん毛モーター Pリング固定子複合体ジスルフィド架橋ペプチドグリカンキメラタンパク質外膜リポタンパク質超分子ナノマシン機能的再構成固定子タンパク質システインスキャニングシステインクロスリンク

项目摘要

細菌のべん毛モーターは運動器官としては生物最小の転モーターである。本研究の目的はべん毛基部体構成因子であるPリングと固定子タンパク質MotBを架橋させることで固定子を回転子とともに単離し、完全な状態のべん毛モーターを単離・再構成することである。昨年度の研究によってPリングを構成するFlgIとMotB間のジスルフィド架橋をタンパク質レベルで確認するところまで達成した。本年度の研究では、さらに架橋方法の探索を推し進め、菌の運動能を損なうことなくFlgIとMotBを架橋する方法を見出した。また、検出された架橋の一部はべん毛に組み込まれたPリングと固定子の間での架橋を反映していることを示唆する結果を得た。これらの結果は、本研究の目的である固定子付きのべん毛モーターの単離に大きく近づくものであり、さらに今まで推測の域を出なかったPリングと固定子の間の相互作用の存在を示唆する初めてのデータである。これと並行して、FlgIとの架橋が確認されたMotB C末端領域のPGBドメインの機能・構造解析を行った。MotBのC末端PGB領域を他の3種のPGBタンパク質のPGB領域と切り換えたキメラMotBを作製し、MotBとしての機能を調べた。作製したキメラMotBは機能しなかったが、キメラ発現株から運動能復帰変異体の取得を試みたところ、外膜リポタンパク質Palとのキメラから、P159L、F172Vという2種の運動能復帰変異体を取得した。F172V変異はPGとの結合能には変化を与えなかったことから、MotBとPalのPGB領域はPG結合能という点で機能的に互換性があることが示された。さらにMotB変異体とPalの立体構造との比較から、MotBとPalのPGB領域の構造的な類似性も示唆された。

细菌鞭毛电动机是生物体生物体中最小的移动电动机。这项研究的目的是交联鞭毛基体组成因子，P环和定子蛋白MOTB，以将定子与转子隔离，并隔离和重建完整的鞭毛运动。去年的研究在蛋白质水平上达到了构成P环的FLGI和MOTB之间的二硫键。今年的研究进一步促进了寻求交联方法的搜索，并找到了一种在不损害细菌运动性的情况下交联的FLGI和MOTB的方法。我们还获得了结果，表明某些检测到的交联反映了鞭毛和定子中掺入的P环之间的交联。这些结果非常接近这项研究的目的，将鞭毛电动机与法定分离隔离，并且是第一个数据表明，直到现在尚未推测的P环与定子之间存在相互作用。同时，确认了与FLGI交联的MOTB C末端区域的PGB结构域的功能和结构分析。产生了一个嵌合MOTB，其中MOTB的C末端PGB区域切换到其他三种PGB蛋白的PGB区域，并研究了其作为MOTB的功能。准备好的嵌合MOTB不起作用，但是当我们尝试从表达嵌合菌株中获得运动恢复突变体时，我们从带有外膜脂蛋白PAL的嵌合体中获得了两种类型的运动恢复突变体P159L和F172V。 F172V突变没有改变与PG结合的能力，表明MOTB和PAL的PGB区域在PG结合能力方面在功能上兼容。此外，MOTB突变体与PAL结构之间的比较表明MOTB和PAL的PGB区域的结构相似性。