タンパク質リン酸化にフォーカスした情報伝達系プロテオーム解析の新規システム開発

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構築したリン酸化物を特異的にトラップする2D-HPLCシステム(Anal Biochem.350,292-297,(2006)Hata,K.,et al.)による、モデルケース分析では良好な結果が得られたが、酵母抽出液のような実サンプルのケースでは、タンパク質分離を含む前処理過程が非常に重要となる事が判明した。そこで、複雑な実サンプル中から、モデルケースと同等純度のタンパク質を精製できる前処理システムを構築し、これと前述のシステムを接続することにより、タンパク質リン酸化にフォーカスした情報伝達系プロテオーム解析の新規システム構築を目指した。さらに、この接続も考慮した上で、モノリスカラムを用いたHPLCによるタンパク質の高速・高性能分離を検討した。そこで、昨年度に引き続き、タンパク質分離を目的としたワイドポアを有するモノリスカラムを調製し、タンパク質分離条件の最適化を行った。蓄積したサンプル回収率、検出限界、定量性のダイナミックレンジ等の基礎データをもとに、最終目標システムに適した分析メソッドを開発した。これにより、多次元分離技術を利用したタンパク質分離が可能となったので、タンパク質分離2D-HPLCシステムを構築した。標準タンパク質サンプルを用いた分析により、タンパク質の2次元分離を行った結果、現在一般的に用いられている2D-PAGE法と比較して、分析時間、再現性、システム拡張性等、このシステムの利点を確認した。さらに、酵母抽出液、シロイヌナズナ抽出液等、実サンプルを用いた分析でも、良好なタンパク質分離が確認できた。このシステムと上記のシステムをオンライン接続させ、リン酸化に焦点をあてた情報伝達系の新規プロテオーム解析システムを構築した。