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機能性ユビキノンプローブの合成と光親和性標識法に基づく標的膜タンパク質の解析

基于光亲和标记的功能性泛醌探针的合成及靶膜蛋白的分析

基本信息

批准号：
07J06470
负责人：
村井正俊
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

ミトコンドリアNADH-ユビキノン酸化還元酵素(複合体-I)は、ATP合成の駆動力となる自由エネルギーの約半分を生産する、呼吸鎖電子伝達系の中でも最も重要な役割を担う酵素である。ヒトでは複合体-Iの機能傷害によって生じた酸化ストレス等が原因となって、パーキンソン病などの神経変性疾患や種々のミトコンドリア病が発症することが報告されている。また、複合体-Iは合成農薬や抗寄生虫薬の有力なターゲットとしても位置づけられていることから、基礎研究のみならず応用的研究の対象としても有望である。H20年度は、前年度に引き続き、複合体-Iのユビキノン還元部位に関する情報を得るため、特異的阻害剤であるキナゾリンを鋳型とした光親和性プローブ[125I]AzQを合成し、ウシ心筋ミトコンドリアに対する光親和性標識実験を行った。各種2次元電気泳動と質量分析を組み合わせて放射能標識されたタンパク質の解析を進めた結果、[125I]AzQは複合体-Iの親水性領域の49kDaサブユニット、および膜貫通領域のND1サブユニットの両者をおよそ4:1の比率で特異的に標識することを明らかにした。[125I]AzQの主たる標識部位となった49kDaサブユニットについては、2006年に明らかになった好熱細菌(T.thermophilus)複合体-Iの部分結晶構造から、このサブユニットはプロトン輸送を司る膜貫通領域との接続部に位置し、ユビキノンの結合ポケットを構成していると考えられている。そこで、49kDaサブユニットをさらに詳細に解析した結果、Asp41-Arg63の23残基が[125I]AzQの結合部位であることを明らかにした。この領域は結晶構造から予想されていたユビキノン結合ポケットの構成領域であり、位置特異的変異によって示唆されている酵母(Y.lipolitica)複合体-Iのユビキノン還元反応に関わる重要アミノ酸をカバーする領域であった。以上のように、本研究では複合体-I阻害剤の結合部位を初めてアミノ酸レベルで明らかにし、かも阻害剤結合部位がユビキノン反応部位の近傍に存在することを証明した初めての報告である。

NADH-ユビキノンAcidification-reducing enzyme (Complex-I), ATP synthesis power NADH About half of the production of free エネルギーの, breathing lock electronic 伝达system の中でも is the most important な伪 Cut を偆 enzyme である.ヒトでは Complex-Iのfunctional damage によって生じたacidification ストレス and other reasons となって, パーキンソン Disease などの神経変 Sexual Disease やkind 々のミトコンドリア Disease が発 syndrome することがreport されている.また、Complex-IはSynthetic pesticide やAnti-parasitic 薬の Potencyなターゲットとしても Locationづけられていることから、Basic research のみならず応与utility research の対 resemble としてもHope である. H20 annual report, the previous year's report, the complex-I's return part information, the special obstacle detection systemンを鋳 type としたPhotoaffinity プローブ[125I]AzQをsynthetic し, ウシ心suji ミトコンドリアに対するPhotoaffinity mark実を行った. Various 2-dimensional electrophoresis and mass analysis groups and radioactive energy labeling and quality analysis results, [125I]AzQ complex-I hydrophilic collar Domain 49kDa サブユニット, および film penetrates the domain ND1 サブユニットの両者をおよそ4:1のratio is a unique にLOGO することを明らかにした. [125I] AzQ's main identification site 49kDa サブユニットについては, 2006 T. thermophilus compound Body-I's partial crystalline structure and its membrane penetration area The position of the joint part is the position of the part, and the combination of the position of the part and the combination of the part and the part are formed.そこで、49kDa サブユニットをさらにDetailed analysis results、Asp41-A The binding site of rg63's 23 residue [125I]AzQ is the same as the binding site.この区はcrystalline structureから conceived of されていたユビキノン combined with ポケットの constitutes the domain であり, position-specific 剉different によって Show唆されていYeast (Y.lipolitica) complex-Iのユビキノン restores the anti-corrosion properties of the important acid をカバーするfield. The above-mentioned のように, in this study, the では complex-I blocking agent's binding site をInitial めてアミノ acid レベルで明らかにし, The existence of the inhibitory agent binding site, the reaction site, and the close proximity of the reaction site are proven.