siRNAライブラリーを用いた海馬長期増強発現に必須なPDZ蛋白質の網羅的な探索

使用 siRNA 文库全面搜索对长期增强海马表达至关重要的 PDZ 蛋白

• 批准号: 07J08691
• 负责人: 武井 大祐
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J08691/
• 关键词: 神経細胞; siRNAライブラリー; スクリーニング; シナプス可塑性

本研究の目的は、海馬神経細胞の長期増強に必須なPDZタンパク質を網羅的に同定することである。昨年度、構築した96ウェルを用いたアッセイ系の安定化を図るために、培養条件と、遺伝子導入法の更なる最適化を行った。次に最適化したハイスループット神経機能解析法の評価を2つの方法で行った。まず、形質膜上のGluR1量を制御していることが知られているStargazinを利用し評価を行った。Stargazinを強制発現した神経細胞において、形質膜上のGluR1量が有意に増加することを確認し、さらにウェル間のばらつきを低減することも確認した。2つ目に、神経細胞へのTTX処理によるsynaptic scalingの評価を行った。TTX処理した神経細胞では形質膜上のGluR1量が有意に増加することを確認した。また、ウェル間のばらつきも小さく再現性が高いことが示された。2つのアッセイ系の評価により、ハイスループット神経機能解析法の有用性が実証された。また、昨年度に引き続き、プログラムの改変により、顕微鏡観察および解析の高速化を行った。本研究では、EPRIL法で作成したshRNAライブラリーを用いて、蛋白質の機能を評価する。EPRIL法はcDNAを多段階酵素処理することにより、shRNAを得る方法である。そのため、調べる対象となる遺伝子のcDNAが必要となる。そこで、マウスの大脳からcDNAライブラリーを構築し、対象となる遺伝子群のクローニングを行った。さらに、単離したcDNAをEPRIL法で処理し、shRNAライブラリーを作成した。今後、ハイスループット神経機能解析法とshRNAライブラリーを組み合わせることで、海馬神経細胞の長期増強発現に必須な分子を同定することが期待できる。

The aim of this study is to determine the identity of PDZ and its related properties for the long-term enhancement of hippocampal neurons. In the past year, the optimization of the culture conditions and the introduction method of the gene was carried out. The second optimization method is to evaluate the function analysis method of the brain. The amount of GluR1 on the plasma membrane is controlled and evaluated. Stargazin stress is found in the brain cells, and GluR1 levels in the plasma membrane are intentionally increased and decreased. 2. Evaluation of synaptic scaling in TTX processing of neurons TTX treatment was confirmed to increase the amount of GluR1 on the plasma membrane of neurons. The reproducibility of this method is very high. 2. The usefulness of the evaluation method of the system of intelligence and intelligence analysis has been verified. In 2010, the company launched a series of research and development projects to improve the quality of products, improve the quality of products and improve the speed of analysis. In this study, we evaluated the function of shRNA by EPRIL method. EPRIL is a multi-stage enzyme processing method. The cDNA of the gene is necessary. A large number of cDNA fragments were constructed and mapped to a large number of cDNA fragments. The EPRIL method was used to process and generate shRNA. In the future, we expect that the molecular identity necessary for the long-term enhancement of hippocampal neurons will be determined by the combination of shRNA and functional analysis of neurons.