siRNAライブラリーを用いた海馬長期増強発現に必須なPDZ蛋白質の網羅的な探索

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本研究の目的は、海馬神経細胞の長期増強に必須なPDZタンパク質を網羅的に同定することである。昨年度、構築した96ウェルを用いたアッセイ系の安定化を図るために、培養条件と、遺伝子導入法の更なる最適化を行った。次に最適化したハイスループット神経機能解析法の評価を2つの方法で行った。まず、形質膜上のGluR1量を制御していることが知られているStargazinを利用し評価を行った。Stargazinを強制発現した神経細胞において、形質膜上のGluR1量が有意に増加することを確認し、さらにウェル間のばらつきを低減することも確認した。2つ目に、神経細胞へのTTX処理によるsynaptic scalingの評価を行った。TTX処理した神経細胞では形質膜上のGluR1量が有意に増加することを確認した。また、ウェル間のばらつきも小さく再現性が高いことが示された。2つのアッセイ系の評価により、ハイスループット神経機能解析法の有用性が実証された。また、昨年度に引き続き、プログラムの改変により、顕微鏡観察および解析の高速化を行った。本研究では、EPRIL法で作成したshRNAライブラリーを用いて、蛋白質の機能を評価する。EPRIL法はcDNAを多段階酵素処理することにより、shRNAを得る方法である。そのため、調べる対象となる遺伝子のcDNAが必要となる。そこで、マウスの大脳からcDNAライブラリーを構築し、対象となる遺伝子群のクローニングを行った。さらに、単離したcDNAをEPRIL法で処理し、shRNAライブラリーを作成した。今後、ハイスループット神経機能解析法とshRNAライブラリーを組み合わせることで、海馬神経細胞の長期増強発現に必須な分子を同定することが期待できる。