高速AFMによるタンパク質の動態機能解明

使用高速 AFM 阐明蛋白质动力学和功能

• 批准号: 07J09305
• 负责人: 山下 隼人
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J09305/
• 关键词: 原子間力顕微鏡; 高速AFM; バイオイメージング; ナノ動態; 膜タンパク質; バクテリオロドプシン; ロドプシン; AFM

本研究は、高速原子間力顕微鏡(高速AFM)を用いて生体膜中における膜タンパク質の動態を高時空間分解能で直接可視化する事で、それらの機能発現過程及び構造変化を捉え、その動態機能を解明する事が目的である。本年度の研究実績を以下に記述する。1.紫膜中でのバクテリオロドプシン(bR)の集合メカニズム及び構造ダイナミクスを明らかにするため、変異体bRを用いた以下の実験を行った。(1)bRが2次元結晶格子に集合する際の構成単位である三量体間での相互作用部位を詳細に明らかにするため、アミノ酸部位特異的変異体bRの作成に取り組んだ。その結果、芳香族残基を持たないアミノ酸に置換した変異体W12Iでは、野生型と比べbRの発現量がかなり低くなる事が分かった。一方、芳香族残基を持つアミノ酸に置換した変異体W12Fでは、野生型と同量の発現に成功し、高速AFM観察により野生型と同じ格子構造を形成する事が分かった。(2)bRの光サイクル時の構造ダイナミクスを明らかにするため、野生型bRと比べて光サイクルが100～1000倍遅い変異体D96Nの高速AFM観察を行い、詳細な動的構造変化を捉える事に成功した。また、その成果を本年度原著論文として報告した。2.脊椎動物視細胞の円盤膜におけるロドプシンとトランスデューシン(Gt)の相互作用を捉えるため以下の実験を行った。円盤膜中で共に拡散するロドプシンとGt分子を区別するため、ロドプシンのみを基盤へ特異的固定化する事に取り組んだ。具体的には、マイカ基盤上にストレプトアビジンの2次元結晶を作成し、ビオチン化したロドプシン抗体を結合させ、その上に円盤膜をのせることで、ロドプシンの固定化を試みた。その結果、ロドプシンC末端抗体を用いた基盤で円盤膜の結合が確認できたが、N末端抗体では、確認できなかった。この事から2重層膜構造である円盤膜の1層化が必要であると考えられる。

In this study, high-speed interatomic force microscopy (high-speed AFM) was used to achieve high temporal and spatial resolution of the dynamic properties of biomass membranes. It can directly visualize the process of the emergence of functions and functions, as well as the purpose of structural changes and dynamic functions. The research achievements of this year are described below. 1.Purple film medium でのバクテリオロドプシン(bR)の集メカニズム和びstructuralダイナミクスを明らかにするため,変variant bRを用いた下の実験を行った. (1) bR is a set of two-dimensional crystal lattice and is composed of a single unit and an interaction part between three-dimensional bodies. The details of the position are clearly defined, and the アミノ acid site-specific allogeneic bR is produced by the んだ group.そのRESULTS, Aromatic residues are replaced by たないアミノAcid and した変 isomers W12I では, wild-type と is lower than べbR の発existing がかなり くなる事が分かった. On the one hand, the aromatic residue is maintained and the acid is substituted, and the allogeneic W12F is used, and the wild type is the same amount. Now we have successfully developed high-speed AFM observation of the wild type and the same lattice structure to form the same structure. (2) bRの光サイクル时のstructural ダイナミクスを明らかにするため, wild type bRと比べて光サイクルが10 The high-speed AFM observation of the variant D96N at 0 to 1000 times, and the structural change of the detailed movement were successfully carried out.また, そのachievementsをThis year’s original paper として report した. 2. The interaction between the vertebrate visual cells and the membrane of the vertebrate disc membrane is the following. In the membrane, there is a special immobilization of the Gt molecules and the specific immobilization of the Gt molecules in the membrane. Specifically, the にストレプトアビジンの2-dimensional crystal was made on the basis of the マイカカし, and the ビオチンしたロThe ドプシン antibody is bound to the させ, the その上に円disk membrane をのせることで, and the ロドプシンのimmobilized みた.その results, ロドプシン C-terminal antibody を use いた base plate で円disk membrane の binding が confirmation できたが, N-terminal antibody では, confirmation できなかった.この事から2 double-layered membrane structure である円 Disk membrane の1-layered がであると考えられる.

项目成果

Dynamic imaging of disassembling and recrystallization processes of bR2D crystals by high speed AFM

高速 AFM 动态成像 bR2D 晶体的分解和再结晶过程

• 发表时间: 2007
• 作者: 姜 舜徹;安田 雅一;宮坂 博;梅山 友和;俣野 善博;吉田 要;磯田 征二;今堀 博;Shibata Mikihiro;Daisuke Yamamoto;Hayato Yamashita;Toshio Ando;Hayato Yamashita;Toshio Ando;山下隼下;山下隼人;山下隼人;山下隼人;Hayato Yamashita
• 通讯作者: Hayato Yamashita

High-resolution dynamic imaging of bacteriorhodopsin in purple membrane by high-speed AFM

高速 AFM 对紫色膜中细菌视紫红质的高分辨率动态成像

• 发表时间: 2008
• 作者: 姜 舜徹;安田 雅一;宮坂 博;梅山 友和;俣野 善博;吉田 要;磯田 征二;今堀 博;Shibata Mikihiro;Daisuke Yamamoto;Hayato Yamashita;Toshio Ando;Hayato Yamashita;Toshio Ando;山下隼下;山下隼人;山下隼人;山下隼人
• 通讯作者: 山下隼人

Direct observation of bacteriorhodopsin molecular interaction in purple membrane by high-speed AFM

高速AFM直接观察紫膜中细菌视紫红质分子相互作用

• 发表时间: 2008
• 作者: 山下隼人;Kislon Voitchovsky;内橋貴之;Sonia Antoranz Contera;John F. Ryan;安藤敏夫
• 通讯作者: 安藤敏夫

高速AFMによる紫膜中のバクテリオロドプシン分子間相互作用の直接観察

使用高速 AFM 直接观察紫色膜中细菌视紫红质分子间相互作用

• 发表时间: 2008
• 作者: 姜 舜徹;安田 雅一;宮坂 博;梅山 友和;俣野 善博;吉田 要;磯田 征二;今堀 博;Shibata Mikihiro;Daisuke Yamamoto;Hayato Yamashita;Toshio Ando;Hayato Yamashita;Toshio Ando;山下隼下;山下隼人;山下隼人
• 通讯作者: 山下隼人

Dynamics of bacteriorhodopsin 2D crystal observed by high-speed atomic force microscopy

• DOI: 10.1016/j.jsb.2009.04.011
• 发表时间: 2009-08-01
• 期刊: JOURNAL OF STRUCTURAL BIOLOGY
• 影响因子: 3
• 作者: Yamashita, Hayato;Voitchovsky, Kislon;Ando, Toshio
• 通讯作者: Ando, Toshio