高速ＡＦＭによる膜輸送タンパク質一分子の動的構造解析

使用高速 AFM 对单个膜转运蛋白分子进行动态结构分析

• 批准号: 12J00228
• 负责人: 山下 隼人
• 金额: $ 2.53万
• 依托单位: Osaka University (2014)Keio University (2012-2013)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J00228/
• 关键词: 高速原子間力顕微鏡; 1分子イメージング; ナノ計測; アクアポリン; ABCトランスポーター; チャネル

本研究は、高速原子間力顕微鏡（高速AFM）を用いて疾患に関与する膜輸送タンパク質1分子を直接可視化する事により、構造ダイナミクスや分子間相互作用を捉え、疾患発症の分子メカニズム解明に繋げる事が目的である。本年度の研究実績を以下に記述する。1. ABCトランスポーター1分子の構造解析昨年度までに構築した測定条件をもとに、ABCトランスポーターの中で唯一のイオンチャネルであり、嚢胞性線維症(CF)の原因タンパク質であるCFTRの1分子観察とその構造解析を行った。CFTRはパッチクランプ法を用いた電流計測により細胞膜中で単量体として機能する事が示唆されてきたが、構造状態に関しては依然として議論が続いていた。高速AFMによる解析の結果、可溶化状態ではほとんどが2量体で、再構成膜中ではほとんどが単量体である事が強く示唆された。これはCFTRの機能ユニットに関する議論に構造的証拠を与えるものと考えられる。2. アクアポリン4(AQP4)の分子集合と「自己免疫疾患」初期分子過程の解明AQP4は脳のアストロサイトで多量に発現し、自己免疫疾患である視神経脊髄炎(NMO)に関与している。そこで、NMO初期過程の分子レベルでの可視化に取り組んだ。昨年度AQP4M23のアレイ集合の可視化に成功したが、本年度はM1を観察した結果、ほとんどのAQP4-4量体が離散分布で、一部がクラスター集合している様子の撮影に成功した。そこで、それぞれにAQP4モノクロナル抗体やNMO-IgGを投与して高速AFM観察を行った結果、アレイのM23やクラスターのM1上では抗体がBivalentに結合し、抗体1分子中の2つのFabを使って、集合AQP4上を（歩くように）ダイナミックに移動している様子が観察された。これらの結果から、AQP4の集合状態が疾患発症の初期過程である抗体結合の親和性に強く関係している事が示唆された。

In this study, high-speed atomic force microarray (high-speed AFM) can be used to directly detect the molecular interaction between the two molecules, and to understand the purpose of the disease. The following notes will be recorded in this year's study. 1. ABC molecular analysis. Last year, CFTR molecular analysis was used to determine the conditions of measurement. This is the only reason why CFTR is the only cause of sexual distress in the last year. The CFTR method uses the current meter to measure the volume of energy in the cell membrane to show that it is instigated and the state of the machine is still in the process of discussion. The results of high-speed AFM analysis, soluble state measurement and measurement, and then the formation of the film will strongly indicate the accuracy of the results. This is the first time that the CFTR machine has been able to conduct a discussion on how to build a computer and how to do it. two。 In the early stage of "self-immune disease", the molecular collection of anti-immune disease 4 (AQP4) was used to understand the pathogenesis of AQP4, immune disease, myelitis (NMO), poliomyelitis (SARS). During the initial stage of NMO, you can access the information of the system by means of molecular analysis. Last year's AQP4M23 collection was able to show success, this year's M1 survey results, AQP4-4 mass measurement, scatter distribution, and a movie about success. The results of the AQP4 antibody test were compared with the results of the high-speed AFM test, the antibody Bivalent binding of the antibody on M1, the activation of the Fab in the antibody 1 molecule, the transfer of the antibody on the AQP4 and the detection of the antibody on the AQP4. The results showed that the antibody of AQP4 aggregative disorder in the early stage of the disease was combined with the antibody of sexual stress disorder and sexual stress disorder.

项目成果

Single molecular observation of CFTR channels by high speed AFM

高速 AFM 对 CFTR 通道的单分子观察

• 发表时间: 2012
• 作者: 平野、中島振一郎;等;三尾 和弘;堀川康史;Kanafusa-Shinkai Sumiyo;山下 隼人
• 通讯作者: 山下 隼人

ATP hydrolysis–driven gating of an ABC transporter CFTR channel: from stills to movies

ATP水解

• DOI: 10.1254/fpj.141.230
• 发表时间: 2013
• 期刊: Folia Pharmacologica Japonica
• 作者: 渡村友昭;田坂裕司;村井祐一;相馬義郎・山下隼人
• 通讯作者: 相馬義郎・山下隼人

高速原子間力顕微鏡 (High-speed AFM) を用いた微生物細胞表層の可視化

使用高速原子力显微镜（高速 AFM）观察微生物细胞表面

• 发表时间: 2014
• 作者: 田岡東;山下隼人;Oestreicher Zachery;福森義宏
• 通讯作者: 福森義宏

Structure and fluctuation of single CFTR molecules observed by high-speed atomic force microscopy

高速原子力显微镜观察单个CFTR分子的结构和波动

• 发表时间: 2014
• 作者: Sohma Y;Yu Y;Nakakuki M;Ishiguro H;Sohma Y;Sohma Y;Sohma Y;Sohma Y;Sohma Y
• 通讯作者: Sohma Y

High speed AFM observation for degradation process of collagen fibril by collagenase

高速AFM观察胶原酶降解胶原原纤维的过程

• 发表时间: 2014
• 作者: 山下隼人;寺村直子;田中啓友;服部俊治;飯嶋克昌;林田治;興津輝;相馬義郎
• 通讯作者: 相馬義郎