高速ＡＦＭによる膜輸送タンパク質一分子の動的構造解析

使用高速 AFM 对单个膜转运蛋白分子进行动态结构分析

• 批准号: 12J00228
• 负责人: 山下 隼人
• 金额: $ 2.53万
• 依托单位: Osaka University (2014)Keio University (2012-2013)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J00228/
• 关键词: 高速原子間力顕微鏡; 1分子イメージング; ナノ計測; アクアポリン; ABCトランスポーター; チャネル

本研究は、高速原子間力顕微鏡（高速AFM）を用いて疾患に関与する膜輸送タンパク質1分子を直接可視化する事により、構造ダイナミクスや分子間相互作用を捉え、疾患発症の分子メカニズム解明に繋げる事が目的である。本年度の研究実績を以下に記述する。1. ABCトランスポーター1分子の構造解析昨年度までに構築した測定条件をもとに、ABCトランスポーターの中で唯一のイオンチャネルであり、嚢胞性線維症(CF)の原因タンパク質であるCFTRの1分子観察とその構造解析を行った。CFTRはパッチクランプ法を用いた電流計測により細胞膜中で単量体として機能する事が示唆されてきたが、構造状態に関しては依然として議論が続いていた。高速AFMによる解析の結果、可溶化状態ではほとんどが2量体で、再構成膜中ではほとんどが単量体である事が強く示唆された。これはCFTRの機能ユニットに関する議論に構造的証拠を与えるものと考えられる。2. アクアポリン4(AQP4)の分子集合と「自己免疫疾患」初期分子過程の解明AQP4は脳のアストロサイトで多量に発現し、自己免疫疾患である視神経脊髄炎(NMO)に関与している。そこで、NMO初期過程の分子レベルでの可視化に取り組んだ。昨年度AQP4M23のアレイ集合の可視化に成功したが、本年度はM1を観察した結果、ほとんどのAQP4-4量体が離散分布で、一部がクラスター集合している様子の撮影に成功した。そこで、それぞれにAQP4モノクロナル抗体やNMO-IgGを投与して高速AFM観察を行った結果、アレイのM23やクラスターのM1上では抗体がBivalentに結合し、抗体1分子中の2つのFabを使って、集合AQP4上を（歩くように）ダイナミックに移動している様子が観察された。これらの結果から、AQP4の集合状態が疾患発症の初期過程である抗体結合の親和性に強く関係している事が示唆された。

这项研究旨在直接使用高速原子力显微镜（高速AFM）可视化参与疾病的膜转运蛋白的单个分子，从而捕获结构动力学和分子间相互作用，从而阐明了疾病发展的分子机制。今年的研究结果如下所述。 1。基于直至去年构建的测量条件的一个ABC转运蛋白分子的结构分析，我们观察并分析了CFTR的结构分析，CFTR是ABC转运蛋白中唯一的离子通道和囊性纤维化的致病蛋白（CF）。尽管已建议通过使用斑块夹方法通过当前测量方法来充当细胞膜中的单体，但结构状态仍然存在争议。使用高速AFM的分析强烈表明，大多数细胞是溶解状态下的二聚体，而重构膜中的大多数细胞都是单体。人们认为这为讨论CFTR的功能单位提供了结构证据。 2。阐明水通道蛋白4（AQP4）的分子组装和“自身免疫性疾病” AQP4的早期分子过程在脑星形胶质细胞中高度表达，并且参与了自身免疫性疾病神经疾病神经瘤炎（NMO）。因此，我们致力于可视化分子水平的初始NMO过程。去年，我们成功地看到了AQP4M23的阵列集，但是由于观察到今年的M1，我们成功拍摄了大多数具有离散分布的AQP4-4 MER，并收集了一些簇。因此，通过对每个抗体和M1的M23对二价抗体进行AQP4单克隆抗体和NMO-IGG进行高速AFM观察，并观察到群集的M23，并在一个抗体分子中使用两个剂量在一个抗体分子中使用两个剂量迁移，在一个抗体分子中迁移，并在组装上迁移了Assemply Aqp4（如果是walkatebly Aqp4）（如果是walkinging a q Qpp4）。这些结果表明，AQP4的组装状态与抗体结合的亲和力密切相关，抗体结合是疾病发展的早期阶段。

项目成果

Single molecular observation of CFTR channels by high speed AFM

高速 AFM 对 CFTR 通道的单分子观察

• 发表时间: 2012
• 作者: 平野、中島振一郎;等;三尾 和弘;堀川康史;Kanafusa-Shinkai Sumiyo;山下 隼人
• 通讯作者: 山下 隼人

ATP hydrolysis–driven gating of an ABC transporter CFTR channel: from stills to movies

ATP水解

• DOI: 10.1254/fpj.141.230
• 发表时间: 2013
• 期刊: Folia Pharmacologica Japonica
• 作者: 渡村友昭;田坂裕司;村井祐一;相馬義郎・山下隼人
• 通讯作者: 相馬義郎・山下隼人

高速原子間力顕微鏡 (High-speed AFM) を用いた微生物細胞表層の可視化

使用高速原子力显微镜（高速 AFM）观察微生物细胞表面

• 发表时间: 2014
• 作者: 田岡東;山下隼人;Oestreicher Zachery;福森義宏
• 通讯作者: 福森義宏

High speed AFM observation for degradation process of collagen fibril by collagenase

高速AFM观察胶原酶降解胶原原纤维的过程

• 发表时间: 2014
• 作者: 山下隼人;寺村直子;田中啓友;服部俊治;飯嶋克昌;林田治;興津輝;相馬義郎
• 通讯作者: 相馬義郎

高速AFMで捉えた膜タンパク質のナノダイナミクス

高速 AFM 捕获的膜蛋白的纳米动力学

• 发表时间: 2012
• 作者: 平野、中島振一郎;等;三尾 和弘;堀川康史;Kanafusa-Shinkai Sumiyo;山下 隼人;堀川康史;新開(金房)純代;山下 隼人
• 通讯作者: 山下 隼人