C3毒素発現マウスを用いた小脳における低分子量Gタンパク質Rhoの機能解析

前年度に、Cre-loxP組換えを用いて小脳プルキンエ細胞特異的にC3毒素を発現するトランスジェニックマウスを複数系統作製したが、小脳懸濁液のウェスタンブロット解析では、C3毒素の発現を検出することができなかった。そこで本年度は、マウスへの薬剤(テトラサイクリンまたはドキシサイクリン)の投与によって遺伝子の発現をオン・オフすることができるTet-OFFシステムを利用したトランスジェニックマウスの作製を試みた。プルキンエ細胞特異的にトランス転写活性化因子tTAを発現するトランスジェニックマウスは、当研究室において既に作製済みであった。よって、tTAが結合するプロモータ配列(TRE)下に、C3遺伝子・IRES・EGFPをタンデムに繋いだトランスジーンを作製した。トランスジェニックマウスの作製に先立って、COS7培養細胞に作製したトランスジーンを導入し、C3およびEGFPの発現を評価した。COS7細胞の蛍光観察の結果、EGFPを発現している細胞は、細胞の形態が著しく変形し、死滅している細胞も多く観察された。これはC3毒素の発現によってRhoが不活性化され、細胞骨格系に異常を来たしたためであると考えられる。さらに、C3およびEGFPの発現は、培地へのテトラサイクリン投与によって消失した。よって、作製したトランスジーンは、C3およびEGFPを薬剤投与依存的に制御できることが確認できた。現在、このトランスジーンを用いて遺伝子改変マウスを作製している。

前年度に、Cre-loxP組換えを用いて小脳プルキンエ細胞特異的にC3毒素を発現するトランスジェニックマウスを複数系統作製したが、小脳懸濁液のウェスタンブロット解析では、C3毒素の発現を検出することができなかった。そこで本年度は、マウスへの薬剤(テトラサイクリンまたはドキシサイクリン)の投与によって遺伝子の発現をオン・オフすることができるTet-OFFシステムを利用したトランスジェニックマウスの作製を試みた。プルキンエ細胞特異的にトランス転写活性化因子tTAを発現するトランスジェニックマウスは、当研究室において既に作製済みであった。よって、tTAが結合するプロモータ配列(TRE)下に、C3遺伝子・IRES・EGFPをタンデムに繋いだトランスジーンを作製した。トランスジェニックマウスの作製に先立って、COS7培養細胞に作製したトランスジーンを導入し、C3およびEGFPの発現を評価した。COS7細胞の蛍光観察の結果、EGFPを発現している細胞は、細胞の形態が著しく変形し、死滅している細胞も多く観察された。これはC3毒素の発現によってRhoが不活性化され、細胞骨格系に異常を来たしたためであると考えられる。さらに、C3およびEGFPの発現は、培地へのテトラサイクリン投与によって消失した。よって、作製したトランスジーンは、C3およびEGFPを薬剤投与依存的に制御できることが確認できた。現在、このトランスジーンを用いて遺伝子改変マウスを作製している。