血管平滑筋の異常収縮シグナル伝達の可視化による解明と創薬スクリーニング

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蛋白発現・精製法、アクチンフィラメント-ミオシンの滑り速度測定法(in vitro motility assay)などの分子・細胞生物学的手法を駆使して、血管異常収縮(=Ca^<2+>非依存性のアクチンフィラメント-ミオシン滑り速度の増加)におけるシグナル分子の役割をリアルタイム可視化解析により検討した。具体的な実績は以下の通りである。(1)リコンビナント蛋白発現系(バキュロウイルス-昆虫細胞Sf9)を用いて、非常に困難とされているリコンビナント平滑筋ミオシンを活性のある形で発現、精製した。(2)血管の異常収縮のシグナル伝達系の鍵を握る分子であるROKでミオシンをリン酸化することに成功した。リン酸化は、SDS-PAGE電気泳動とProQ Diamond染色で確認した。(3)ROKでリン酸化された上記のミオシフンを用いて、ミオシンとアクチンとの滑り運動(=血管の異常収縮)をカルシウム非存在化で、リアルタイム可視化解析することに成功し、その速度解析を行った。この滑り運動が起きたことは、スキンド血管組織でカルシウム非存在化でのROKタンパク質投与時の収縮結果(JBC, 1997)を純粋なin vitro の系でも再現できたことを意味する。また、滑り運動速度はカルシウム依存性の正常収縮時の滑り運動速度とほぼ同じであった。これらの成果は、日本生物物理学会(2007年3月)、日本生理学会(2008年3月)で学会発表し、非常に高い評価を得た。よって、本研究課題は、順調に遂行された。なお、本研究は、山口大学組換えDNA実験安全委員会の承認および山口大学動物実験規則に基づく動物実験委員会の承認を得ている。