血管平滑筋の異常収縮シグナル伝達の可視化による解明と創薬スクリーニング

通过血管平滑肌异常收缩信号传输的可视化进行阐明和药物发现筛选

基本信息

批准号：
18700391
负责人：
川道穂津美
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Yamaguchi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

蛋白発現・精製法、アクチンフィラメント-ミオシンの滑り速度測定法(in vitro motility assay)などの分子・細胞生物学的手法を駆使して、血管異常収縮(=Ca^<2+>非依存性のアクチンフィラメント-ミオシン滑り速度の増加)におけるシグナル分子の役割をリアルタイム可視化解析により検討した。具体的な実績は以下の通りである。(1)リコンビナント蛋白発現系(バキュロウイルス-昆虫細胞Sf9)を用いて、非常に困難とされているリコンビナント平滑筋ミオシンを活性のある形で発現、精製した。(2)血管の異常収縮のシグナル伝達系の鍵を握る分子であるROKでミオシンをリン酸化することに成功した。リン酸化は、SDS-PAGE電気泳動とProQ Diamond染色で確認した。(3)ROKでリン酸化された上記のミオシフンを用いて、ミオシンとアクチンとの滑り運動(=血管の異常収縮)をカルシウム非存在化で、リアルタイム可視化解析することに成功し、その速度解析を行った。この滑り運動が起きたことは、スキンド血管組織でカルシウム非存在化でのROKタンパク質投与時の収縮結果(JBC, 1997)を純粋なin vitro の系でも再現できたことを意味する。また、滑り運動速度はカルシウム依存性の正常収縮時の滑り運動速度とほぼ同じであった。これらの成果は、日本生物物理学会(2007年3月)、日本生理学会(2008年3月)で学会発表し、非常に高い評価を得た。よって、本研究課題は、順調に遂行された。なお、本研究は、山口大学組換えDNA実験安全委員会の承認および山口大学動物実験規則に基づく動物実験委員会の承認を得ている。

使用分子和细胞生物学技术，例如蛋白质表达和纯化方法以及体外运动测定，通过实时可视化分析研究了信号分子在异常血管收缩中的作用（= Ca^<2+> - 肌动蛋白丝状肌球蛋白滑移速率的独立增加）。具体结果如下：（1）重组平滑肌肌球蛋白被认为极其困难，并使用重组蛋白表达系统（杆状病毒 - 启用细胞SF9）以活性形式表达和纯化。（2）我们用ROK成功地将肌球蛋白磷酸化，ROK是一种分子，它是异常血管收缩信号系统的关键。 SDS-PAGE电泳和ProQ钻石染色证实了磷酸化。（3）使用上面用ROK磷酸化的上述肌中洪在没有钙的情况下成功地可视化并分析了肌球蛋白和肌动蛋白和肌动蛋白的滑动运动（=血管的异常收缩），并分析了肌球蛋白的速度。这种滑动运动意味着在没有钙的情况下，皮肤血管组织中ROK蛋白给药期间的收缩结果（JBC，1997）可以在纯净体外系统中再现。此外，滑动运动速度几乎与正常收缩期间的滑动运动速度相同，这取决于钙。这些结果是在日本生物物理学会（2007年3月）和日本生理学会（2008年3月）的会议上提出的，并受到了极大的赞誉。因此，该研究主题是顺利进行的。这项研究得到了Yamaguchi大学的重组DNA实验安全委员会的批准，并根据Yamaguchi大学的动物实验规则批准了动物护理委员会。

项目成果

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专利数量（0）

The involvement of cholesterol and membrane rafts in the signaltransduction of abnormal vascular smooth muscle contraction.

胆固醇和膜筏参与异常血管平滑肌收缩的信号转导。

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
影响因子：
0
作者：
F.Guo;et al.;小林誠;C.wang;C.wang;H. Kawamichi;S. Kobayashi;H. Kishi;D. Xu;K. Kajiya;郭鳳玲;加治屋勝子;川道徳津美;H. Kawamichi;小林誠;岸博子;Hiroko Kishi
通讯作者：
Hiroko Kishi

The screening for selective inhibitors of Rho-kinase-mediated Ca^2+sensitization of vascular smooth muscle (VSM) contraction

Rho激酶介导的血管平滑肌（VSM）收缩Ca^2敏化选择性抑制剂的筛选

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
影响因子：
0
作者：
F.Guo;et al.;小林誠;C.wang
通讯作者：
C.wang

Development of method to measure the serum concentration of sphingosylphosphorylcholine, an inducer of abnormal vascular contraction.

开发了测量异常血管收缩诱导剂鞘氨酰磷酸胆碱血清浓度的方法。

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
The Journal of Physiological Sciences 57
影响因子：
0
作者：
F.Guo;et al.;C.Wang et al.;S.Matsuo et al.;Y.Takada et al.
通讯作者：
Y.Takada et al.

血管平滑筋のカルシウム非依存性収縮におけるFynテロシンキナーゼの重要性

Fyn 酪氨酸激酶在血管平滑肌钙依赖性收缩中的重要性

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
影响因子：
0
作者：
F.Guo;et al.;小林誠;C.wang;C.wang;H. Kawamichi;S. Kobayashi;H. Kishi;D. Xu;K. Kajiya;郭鳳玲
通讯作者：
郭鳳玲

Fyn tyrosine kinase is a novel signal molecule of the rho-kinasemediated-abnormal contraction of vascular smooth muscle.

Fyn酪氨酸激酶是rho激酶介导的血管平滑肌异常收缩的新型信号分子。

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
影响因子：
0
作者：
F.Guo;et al.;小林誠;C.wang;C.wang;H. Kawamichi;S. Kobayashi;H. Kishi;D. Xu;K. Kajiya;郭鳳玲;加治屋勝子;川道徳津美;H. Kawamichi
通讯作者：
H. Kawamichi