カルシウム感受性のあるミオシン分子のモーター・ドメインの機能と構造

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ミオシン(従来型ミオシンII)は、代表的なモーター蛋白質であり、ATPの分解による化学エネルギーを運動という機械的エネルギーに変換する機能を持っている。その構造と機能の解明には、発現蛋白質として得ることが不可欠と考えられる。ミオシンの制御には、リン酸化によるタイプとCa^<2+>を結合するタイプに分かれるが、本研究で取り扱う真正粘菌フィザルム・ミオシンは後者に相当するが、このタイプのミオシンの発現蛋白質化は成功例がない。本年は、フィザルム・ミオシンHMMを3種類のバキュロウイルス(重鎖のHMM領域を発現するウイルス、必須軽鎖を発現するウイルス、制御軽鎖を発現するウイルス)を用い、昆虫細胞Sf-9で複合体蛋白質として共発現させた。発現したHMMを精製し、ATPase活性を測定し、そのATPase活性はアクチン存在下で活性化されることを検出することができた。また、制御軽鎖のリン酸化によりATPase活性が増加することを検出した。in vitro motility assayによる運動測定では、Ca^<2+>によるモーター活性の抑制と制御軽鎖のリン酸化によるモーター活性の活性化を検出した。さらに、Ca^<2+>を結合しない変異必須軽鎖ウイルスを作成し、mutant HMMを発現させ、この機能解析により、カルシウム感受性を欠いたHMMの発現に成功したことが確かめられた。また、HMMの大量発現と精製法の改良も行い、X線結晶解析のための結晶化の準備が整った。以上、カルシウム感受性のあるミオシン分子モーターの機能解析がさらに前進し、X線結晶解析への途も開かれた。