新奇RNA結合タンパク質・Wnterによる体軸形成とWntシグナル伝達の制御機構

新型RNA结合蛋白Wnter控制体轴形成和Wnt信号转导的机制

• 批准号: 19870015
• 负责人: 宮本 達雄
• 金额: $ 2万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-19870015/
• 关键词: 発生・分化; シグナル伝達

<研究目的> 多細胞動物の発生過程において、前後、背腹、左右の体軸の形成とそれに伴う細胞の増殖・分化の分子機構の解明は、個体発生のメカニズムを理解する上で必要不可欠である。ツメガエルの背腹軸形成を制御する因子を、発現クローニング法によって探索した結果、Wntシグナル伝達系を特異的に促進する新奇RNA結合蛋白質・Wnterを同定した。本研究は、1)ツメガエル胚と培養細胞を用いたWnterの過剰発現および機能阻害実験によって、Wnterによる体軸形成と発生・分化の制御機構を明らかにする。また、2)Wnterの標的RNAを同定することによって、WnterによるRNAレベルでのWntシグナル伝達制御機構を解明する。これらの解析から、今まで研究が十分になされていないRNAレベルでの初期発生制御のメカニズムを明らかにすることを目的とする。<研究成果> 平成19年度は、ツメガエル初期胚とヒト培養細胞を用いてWnterの過剰発現実験を行った。また、Wnter標的RNAの同定に使用する抗ヒトWnter(hWnter)抗体の作製を行った。<成果1> Wnter mRNAをXWnt8 mRNAとともにカエル胚に注入すると、XWnt8単独の場合に比べて背側化が亢進し、相乗的なWnt標的遺伝子の発現が得られた。また、HeLa細胞においても、WnterはWnt刺激によるWnt応答遺伝子の発現を亢進させる活性をもつことが明らかになった。<成果2> Wnterの標的RNAの同定に有効なCLIP法を行うための準備段階として、hWnterに対するポリクロナール抗体を作製した。Wnter-GFPを発現するHeLa細胞を用いた検討から、本抗体が、Wnterタンパク質を特異的に認識し、免疫沈降、免疫染色、ウエスタンブロットに使用できることが明らかとなった。

<目的是在多细胞动物的发展过程中进行研究，必须了解前后，背腹和左右身体轴的形成的分子机制，以及伴随着这些细胞的增殖和分化，以便了解发作机制。通过表达克隆方法搜索了调节爪蟾背腹轴形成的因素，并确定了新型的RNA结合蛋白Wnter，该蛋白专门促进了Wnt信号传导系统。这项研究揭示了通过使用Xenopus Embryos和培养的细胞对WNTER轴形成，开发和分化的机制。 2）识别WNTER的靶RNA，阐明了Wnter在RNA水平上Wnter调控Wnt信号的机制。这些分析旨在阐明在RNA水平上初始发育调控的机制，该机制尚未得到充分研究。 <研究结果>在2007年，使用早期爪蟾胚胎和人培养的细胞进行了过度表达实验。另外，制备了用于鉴定靶靶RNA的抗人类WNTER（HWNTER）抗体。 <结果1>与单独的XWNT8相比，将XWNT8 mRNA注射XWNT8 mRNA在青蛙胚胎中增加了反向化，从而导致Wnt靶基因的协同表达。还揭示了Wnter具有通过刺激HeLa细胞来增加Wnt响应基因表达的活性。 <结果2>针对HWNTER的多克隆抗体作为制备步骤，用于执行有效识别WNTER靶RNA的夹子方法。使用表达GFP的HELA细胞的研究表明，该抗体特异性识别蛋白质，可用于免疫沉淀，免疫染色和蛋白质印迹。