新規蛍光発生システムによる遺伝子シグナルの増幅

使用新型荧光发生系统放大基因信号

基本信息

批准号：
10J10573
负责人：
中嶋裕子
金额：
$ 1.21万
依托单位：
Ochanomizu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2013-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J10573/
关键词：
遺伝子検出蛍光分子求核置換反応

项目摘要

本研究課題では、遺伝子シグナルを増幅させることにより高感度検出することを目的としている。本年度は、求核剤による芳香族求核置換反応を引き金とする新規蛍光発生分子システムの開発を行った。蛍光プローブの基本骨格としてアミノクマリンを用いた。アミノクマリンを、塩基性下、2,4-ジニトロベンゼンスルホニルクロリドで処理することにより、蛍光発生分子を合成した。さらに、合成した蛍光分子をDNAとカップリングさせることにより蛍光プローブを合成した。求核剤となるホスホロチオエート基を導入したDNAプローブは、DNA自動合成機により合成を行った。アミノクマリンをジニトロベンゼンスルホニル基で保護した化合物と求核剤となるホスホロチオエート基を導入したプローブを標的遺伝子上で反応させた結果、ジニトロベンゼンスルホニル基が脱保護されたことにより蛍光の上昇が観察された。一方、1つミスマッチを含む配列や標的配列非存在下では、蛍光シグナルの増加はほとんど観察されなかった。これらの結果より、本プローブは、芳香族求核置換反応により標的核酸配列特異的に蛍光シグナルを発生することが明らかとなった。今後は、生細胞内での検出を目指し、より長波長の蛍光化合物(ローダミンなど)で検討する予定である。

该研究主题旨在通过扩增基因信号来高度敏感。今年，我们开发了一种新型的荧光分子系统，该系统是由芳香的亲核取代反应触发的。将氨基氨基蛋白酶用作荧光探针的基本骨干。通过在碱性下用2,4-二硝基苯甲磺酰氯处理氨基甲酰蛋白，合成荧光分子。此外，通过将合成的荧光分子与DNA偶联来合成荧光探针。使用自动DNA合成器合成了引入磷酸硫酸酯基的DNA探针作为亲核试剂。由氨基氨基甲素保护的化合物和二硝基苯磺酰基组和探针引入了磷酸硫酸盐基团作为核粒子的探针在靶基因上反应，因此，二硝基苯二磺磺酰基组脱离，导致荧光增加。另一方面，在没有包含一个不匹配或目标序列的序列的情况下，几乎没有观察到荧光信号的增加。这些结果表明，该探针通过芳族亲核取代反应在靶核酸序列中特异性产生荧光信号。将来，我们计划使用更长的波长荧光化合物（例如若丹明）进行研究，目的是在活细胞中检测。