食道上皮細胞の維持・再生，　腫瘍増殖を担う幹細胞の同定

鉴定负责食管上皮细胞维持和再生以及肿瘤生长的干细胞

• 批准号: 14J07950
• 负责人: 田中 敏宏
• 金额: $ 1.91万
• 依托单位: Kansai Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-04-25 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J07950/
• 关键词: 食道上皮幹細胞; stem cell; Sox2; Bmi1

当研究室においてカラー細胞系譜追跡法を用いて,tamoxifen投与にてランダムに食道上皮を3色の蛍光標識が可能となり, 長期経過観察にて食道上皮に単色のパッチ上の領域を確認し, その領域の境界は明瞭であった. その単色の領域は1個の幹細胞由来の細胞のみで構成されており, 1個の幹細胞が存在する事が考えられた.〈Sox2〉食道上皮細胞基底細胞付近に広くSox2陽性細胞が存在している事を確認した.当講座においてin vitro解析でのorganoid形成が食道上皮において可能であった. そこでSx2-GFP miceを用いて解析を行い,Sox2陽性細胞と陰性細胞にFACSを用いて分離するとSox2陽性細胞のみからorganoid形成を認めた.またSox2のCre knock-in miceにおいてSox2陽性細胞の細胞系譜追跡を行い,12weeksにおいても単色の細胞領域を認め,Sox2陽性細胞内にin vitroでもin vivoにおいても長期に食道上皮を維持する幹細胞を含む事を確認した.そこでSox2-GFP single cell RNA-seqの解析においてHopx,Lrig1,HopxがSox2に共発現している事を確認し,その他各発現遺伝子の相互関係等詳細な検討は現在も解析中である.またBmi1 probeを用いたin situ hybridizationにおいてBmi1陽性細胞が食道基底細胞付近に存在する事が示唆された事より基底細胞付近のSox2陽性細胞及びBmi1-GFP miceを用いたBmi1陽性細胞との関係の差異を示す事でheterogeneityの存在を示す手がかりとなると考え, Sox2-GFP vs Bmi1-GFP highとBmi1-GFP high vs Bmi1-GFP lowにてqPCRを用いた各幹細胞マーカーやケラチン等の分化マーカー等の解析を細胞の分離からRNA抽出・cDNA作成を経由して現在解析中である.〈Bmi1〉Bmi1のin situ hybridization/ single molecular FISHを行い食道上皮の基底細胞付近に集積を確認した. そこでBmi1Cre knock-in miceを用いてBmi1creER/+/Rosa26rbw/+ mice にtamoxifen投与後の細胞系譜追跡を施行し長期間のlineage tracingを確認した.

When using the method of cell genealogy tracing in laboratory,tamoxifen was applied to the esophageal epithelium in the middle of the study, and the three-color fluorescent label was possible. Long-term observation of the esophageal epithelium in the middle of the study confirmed the color of the upper part of the study area, and the boundary of the study area was clear. The stem cells are derived from stem cells, and the stem cells exist in a single domain. The presence of Sox2 positive cells near basal cells of esophageal epithelium was confirmed. When the lecture is in vitro, the organoid is formed and the esophageal epithelium is formed. Sx2-GFP mice were analyzed by FACS to isolate Sx2-positive cells from Sx2-negative cells. Cell pedigree tracing of Sox2 and Cre knock-in mice,12weeks for single cell domain identification,Sox2 positive cells in vitro in vivo, long-term esophageal epithelium maintenance, stem cell presence confirmed. The analysis of SOX2-GFP single cell RNA-seq was carried out in detail, including confirmation of the co-occurrence of Hopx, Lrig1,Hopx and SOX2, and the relationship between other genes. Bmi1 probe in situ hybridization indicates the presence of Bmi 1-positive cells near basal cells in the esophagus, indicating the difference between Sox2-positive cells near basal cells and Bmi1-GFP mice in situ hybridization indicates the presence of heterogeneity. Sox2-GFP vs Bmi 1-GFP high vs Bmi 1-GFP high vs Bmi1-GFP low qPCR analysis of stem cells, RNA extraction, cDNA generation, cell isolation, RNA extraction, and cDNA generation. <Bmi1> Bmi1 in situ hybridization/ single molecular FISH confirmed the accumulation of basal cells in esophageal epithelium. Bmi1Cre knock-in rice, Bmi1creER/+/Rosa26rbw/+ rice, tamoxifen, and cell lineage tracing were performed for a long time.