膜型エストロゲン受容体ＧＰＲ３０の新規調節機構の解明

【研究目的】本研究では、膜型エストロゲン受容体GPR30の細胞内局在とシグナル伝達を調節する新規分子機構を解明し、性差医療の基盤を構築する。GPR30の細胞内局在がどのように調節されているのか、また、異なる局在が与える機能的な意義は何かを明らかにする。【研究計画と実施状況】1) GPR30発現細胞における細胞内局在の観察: 共焦点レーザー顕微鏡を用いた細胞免疫染色では小胞体オルガネラーカーとの共局在が認められた。2) GPR30を介した細胞内シグナル伝達: GPR30安定発現細胞を用い、細胞内カルシウム測定アッセイやTGFα切断実験などのGPCR機能アッセイを行い、エストラジオールやアルドステロン、GPR30選択的アゴニストG1、アンタゴニストG15による細胞内シグナル伝達への影響を解析した。3) GPR30調節タンパクの同定と機能解析：GPCRの局在とリガンド選択性を変えると報告されているreceptor-activity-modifying proteins (RAMPs)をGPR30と共発現させ、GPR30の細胞内局在とシグナル伝達への影響を解析した。RAMPsの共発現は、GPR30の細胞内局在とシグナル伝達へ影響を与えなかった。4) GPR30ノックアウトマウスの樹立：CRISPR/Cas9システムを用いてGPR30ノックアウトマウスを樹立した。5) GPR30発現臓器・発現細胞の同定：各臓器でのGPR30の発現量を定量PCRで解析した。GPR30の発現量の高かった臓器に関しては、in situ hybridization でGPR30が発現する細胞を同定した。6) GPR30ノックアウトマウスの表現型解析：無刺激・無負荷下で、血圧・体重・脈拍等の生理パラメーター測定と血液・尿検査、表現型解析を行った。

【研究目的】本研究では、膜型エストロゲン受容体GPR30の細胞内局在とシグナル伝達を調節する新規分子機構を解明し、性差医療の基盤を構築する。GPR30の細胞内局在がどのように調節されているのか、また、異なる局在が与える機能的な意義は何かを明らかにする。【研究計画と実施状況】1) GPR30発現細胞における細胞内局在の観察: 共焦点レーザー顕微鏡を用いた細胞免疫染色では小胞体オルガネラーカーとの共局在が認められた。2) GPR30を介した細胞内シグナル伝達: GPR30安定発現細胞を用い、細胞内カルシウム測定アッセイやTGFα切断実験などのGPCR機能アッセイを行い、エストラジオールやアルドステロン、GPR30選択的アゴニストG1、アンタゴニストG15による細胞内シグナル伝達への影響を解析した。3) GPR30調節タンパクの同定と機能解析：GPCRの局在とリガンド選択性を変えると報告されているreceptor-activity-modifying proteins (RAMPs)をGPR30と共発現させ、GPR30の細胞内局在とシグナル伝達への影響を解析した。RAMPsの共発現は、GPR30の細胞内局在とシグナル伝達へ影響を与えなかった。4) GPR30ノックアウトマウスの樹立：CRISPR/Cas9システムを用いてGPR30ノックアウトマウスを樹立した。5) GPR30発現臓器・発現細胞の同定：各臓器でのGPR30の発現量を定量PCRで解析した。GPR30の発現量の高かった臓器に関しては、in situ hybridization でGPR30が発現する細胞を同定した。6) GPR30ノックアウトマウスの表現型解析：無刺激・無負荷下で、血圧・体重・脈拍等の生理パラメーター測定と血液・尿検査、表現型解析を行った。