The Functional Analysis of Btk/Btk29A for Stem Cell Research

これまでの実験により、Btk29Aにより転写が制御されている因子に依存してエスコート細胞から何らかのリガンドが生成され、その作用を受けて二次生殖幹細胞CBは分化を開始すると推測した。そこでこの未知のリガンドの探索を試みた。よりBtk29A依存的な下流因子のスクリーニングを実現する目的で、まずは常時活性型Btk29Aの優性表現型をハプロイドで抑制する欠失染色体をゲノムワイドにスクリーニングすることとした。そして、抑制効果の見られた欠失中に存在する全ての遺伝子についてUAS-RNAiによるノックダウンを行い、欠失染色体での効果を再現するノックダウン遺伝子を探索する計画を立てた。この計画を実行する為には、まずは常時活性型Btk29Aを発現させることのできる新たな系統が必要となる。しかし現時点でBtk29Aの常時活性化作成に必要となるアミノ酸サイトも置換残基も明らかになっていない。そこで、ヒトBtkの異常により引き起されるヒト遺伝性免疫不全症XLAの罹患者が持つBtk変異のBtk29A相同部位に変異を入れた系統を複数作成し、活性の変化を観察することとした。この実験に際し、活性の変化による表現型が軽易に評価できるのは複眼であることから、まずは常時活性型Btk29Aの候補を複眼で発現させ、rough-eye表現型になるか否かを観察することとした。実験の結果、候補の１つを発現させた複眼で非常に重度のrough-eye表現型が観察された。続いて、この活性型候補をエスコート細胞に強制発現させ、生殖細胞への影響の有無を検討した。すると、この活性型候補を発現させた卵巣では、殆どのgermariumでCBの増加が見られた。これらの結果から、本実験により得られた活性型候補をBtk29Aの常時活性型として今後のスクリーニングに用いることとした。

これまでの実験により、Btk29Aにより転写が制御されている因子に依存してエスコート細胞から何らかのリガンドが生成され、その作用を受けて二次生殖幹細胞CBは分化を開始すると推測した。そこでこの未知のリガンドの探索を試みた。よりBtk29A依存的な下流因子のスクリーニングを実現する目的で、まずは常時活性型Btk29Aの優性表現型をハプロイドで抑制する欠失染色体をゲノムワイドにスクリーニングすることとした。そして、抑制効果の見られた欠失中に存在する全ての遺伝子についてUAS-RNAiによるノックダウンを行い、欠失染色体での効果を再現するノックダウン遺伝子を探索する計画を立てた。この計画を実行する為には、まずは常時活性型Btk29Aを発現させることのできる新たな系統が必要となる。しかし現時点でBtk29Aの常時活性化作成に必要となるアミノ酸サイトも置換残基も明らかになっていない。そこで、ヒトBtkの異常により引き起されるヒト遺伝性免疫不全症XLAの罹患者が持つBtk変異のBtk29A相同部位に変異を入れた系統を複数作成し、活性の変化を観察することとした。この実験に際し、活性の変化による表現型が軽易に評価できるのは複眼であることから、まずは常時活性型Btk29Aの候補を複眼で発現させ、rough-eye表現型になるか否かを観察することとした。実験の結果、候補の１つを発現させた複眼で非常に重度のrough-eye表現型が観察された。続いて、この活性型候補をエスコート細胞に強制発現させ、生殖細胞への影響の有無を検討した。すると、この活性型候補を発現させた卵巣では、殆どのgermariumでCBの増加が見られた。これらの結果から、本実験により得られた活性型候補をBtk29Aの常時活性型として今後のスクリーニングに用いることとした。