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ガン特異的TCR遺伝子を簡便・迅速に取得するシステムの構築

构建轻松快速获取癌症特异性TCR基因的系统

基本信息

批准号：
15K06872
负责人：
浜名洋
金额：
$ 3.24万
依托单位：
University of Toyama
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-01 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

TCR遺伝子治療においては、いかにして個々の患者から迅速にガン特異的TCR遺伝子を取得するかが重要な課題の1つである。本研究では「ガン特異的TCR遺伝子を簡便・迅速に取得するシステムの構築」を目的として研究を行った。初年度は、単一T細胞からTCR cDNAを効率よく簡便に増幅するために、One-step multiplex RT-PCRを用いた方法を確立した。これにより、ヒトおよびマウスの単一T細胞から、80%以上の効率でTCRαβ cDNAの増幅が可能となった。また、TCRの機能を迅速に解析するために遺伝子改変細胞(293T-Luc)を作製した。この細胞を用いたルシフェラーゼ・レポーターアッセイにより、最短4日でTCRの抗原特異性を評価することが可能となった。また、C57BL/6マウスのB16F10メラノーマ腫瘍浸潤T細胞(TIL)を取得し、それらから我々のPCR法により迅速・簡便にTCR cDNAの増幅が可能であることを確認した。次年度は、5匹の担癌マウスから取得したCD8+CD137+ TIL由来TCR遺伝子(13種類)をレトロウイルスベクターを用いてマウス脾臓由来のT細胞に遺伝子導入した。そして、そのT細胞とB16F10を共培養し細胞傷害活性を検討した。その結果、9種類のTCR遺伝子導入T細胞においてB16F10に対する細胞障害活性が認められらた。次に、ルシフェラーゼを恒常的に発現するB16F10細胞株B16F10-Lucを作成し、この細胞を用いてマウスの肺転移モデルによりTCRの細胞傷害活性能を評価した。in vitroで細胞障害活性の高かった2種類のTCR遺伝子導入細胞T細胞を用いてB16F10-Lucの肺転移を、5匹のマウスで解析した。その結果、2種類のTCR遺伝子導入細胞T細胞はコントロールに比べ優位にB16F10-Lucの肺転移を抑制することが示された。

TCR gene therapy is an important topic for patients to rapidly acquire specific TCR genes. The purpose of this study is to study how to construct a simple and rapid TCR system. In the early years, the TCR cDNA amplification was simple, and One-step multiplex RT-PCR was established. TCRαβ cDNA amplification is possible at a rate of more than 80%. In addition, the function of TCR can be quickly analyzed and genetically modified cells (293T-Luc) are produced. This cell is used to evaluate the specificity of TCR antigen in the shortest time possible. TCR cDNA amplification is possible by PCR. In the following year, 5 TCR genes were obtained, CD8 + CD137 + TCR genes (13 species) were introduced into T cells derived from TCR genes. T cells and B16F10 co-culture to investigate cell injury activity 9 kinds of TCR genes were introduced into T cells, and the cell damage activity of B16F10 was recognized. In addition, the cell cycle of B16F10 cell line B16F10-Luc was established and the cell cycle of B16F10-Luc was evaluated. Two types of TCR genes were introduced into T cells with high cell-barrier activity in vitro and analyzed by B16F10-Luc. The results showed that two types of TCR genes were introduced into T cells to inhibit lung metastasis compared with B16F10-Luc.