筋機能再活性へ向けた基礎研究-骨髄SP細胞を筋分化させるストレス強度の解析

筋機能再活性に関与するメカニズムの一端を解明するため、骨髄SP細胞がメカニカルストレスにより筋へ分化する適刺激を求め、その際に発現する特異的タンパクを同定することを目的として実験を行った。実験に際しては、まずGFPマウス大腿骨より骨髄細胞を取り出し、Hoechst33342を適量添加しFACS解析により骨髄SP細胞を単離した。得られたGFP陽性骨髄SP細胞とマウス骨格筋筋芽細胞株C2C12とを伸展装置専用の培養プレート(BioFlex:ウェル径25mm)に播種し共培養を行った。生着のために1日間10%FBS入りDMEMにて培養後、2%FBS入りDMEMに培養液を交換し、伸展刺激を開始した。今年度は伸展強度を0%(コントロール)、5%、10%、15%、20%とし、1日1時間伸展刺激を加え、5日後に筋線維へどれだけ分化しているか確認を行った。伸展刺激を加えた結果より、コントロールに比べて伸展刺激を加えた方が、骨髄SP細胞が融合したと思われるGFP陽性の筋管様細胞を多く確認できた。特に10%と15%の伸展刺激の場合に多くGFP陽性筋管様細胞を確認した。次に筋分化促進を確認するため、ウエスタンブロッティング法を用いて筋分化する際に発現する特異的タンパクを定量解析した。今年度は、筋特異的転写調節因子のMyoD、myogeninと成長因子であり初期の筋分化に必要といわれているIGF-1、TGF-ss1について解析を行った。観察の結果と同様にすべての因子において10%と15%で他の伸展強度より強い発現が認められた。以上から骨髄SP細胞が筋へ分化する適刺激は約10～15%の伸張刺激であると考えられた。今回の研究より、筋機能再活性には刺激が必要だが、適度な刺激を加えれば再活性に必要な因子が最も活性化されると示唆された。今後は詳細な適刺激と筋機能再活性に特異的に働くタンパクの同定が必要である。

筋機能再活性に関与するメカニズムの一端を解明するため、骨髄SP細胞がメカニカルストレスにより筋へ分化する適刺激を求め、その際に発現する特異的タンパクを同定することを目的として実験を行った。実験に際しては、まずGFPマウス大腿骨より骨髄細胞を取り出し、Hoechst33342を適量添加しFACS解析により骨髄SP細胞を単離した。得られたGFP陽性骨髄SP細胞とマウス骨格筋筋芽細胞株C2C12とを伸展装置専用の培養プレート(BioFlex:ウェル径25mm)に播種し共培養を行った。生着のために1日間10%FBS入りDMEMにて培養後、2%FBS入りDMEMに培養液を交換し、伸展刺激を開始した。今年度は伸展強度を0%(コントロール)、5%、10%、15%、20%とし、1日1時間伸展刺激を加え、5日後に筋線維へどれだけ分化しているか確認を行った。伸展刺激を加えた結果より、コントロールに比べて伸展刺激を加えた方が、骨髄SP細胞が融合したと思われるGFP陽性の筋管様細胞を多く確認できた。特に10%と15%の伸展刺激の場合に多くGFP陽性筋管様細胞を確認した。次に筋分化促進を確認するため、ウエスタンブロッティング法を用いて筋分化する際に発現する特異的タンパクを定量解析した。今年度は、筋特異的転写調節因子のMyoD、myogeninと成長因子であり初期の筋分化に必要といわれているIGF-1、TGF-ss1について解析を行った。観察の結果と同様にすべての因子において10%と15%で他の伸展強度より強い発現が認められた。以上から骨髄SP細胞が筋へ分化する適刺激は約10～15%の伸張刺激であると考えられた。今回の研究より、筋機能再活性には刺激が必要だが、適度な刺激を加えれば再活性に必要な因子が最も活性化されると示唆された。今後は詳細な適刺激と筋機能再活性に特異的に働くタンパクの同定が必要である。