フォワードジェネティクスで同定した新規睡眠制御遺伝子による睡眠覚醒制御機構の解明

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1.リン酸化酵素SIK3の変異による睡眠量の増大と、明瞭な系統学的保存性。Sik3変異はエクソンをスキップするスプライス変異となる。スキップするエクソンがコードする52アミノ酸は脊椎動物間でよく保存されいる。この中には、ショウジョウバエや線虫でも保存されているPKAリン酸化部位が存在する。PKAリン酸化部位のセリンをアラニンに置換したSIK3を強制的に発現誘導させたところ、ショウジョウバエの睡眠様行動が延長した。2. CRISPR法を用いたNalcn遺伝子改変マウスの作成と解析。同定したNalcn遺伝子変異のレム睡眠異常への因果性を証明するため、CRISPR法を用いて、Dreamless変異マウスに見出された1塩基変異をNalcn遺伝子に導入した。その結果、Dreamless変異マウスのレム睡眠短縮を再現することができた。3. パッチクランプ法によるNalcn遺伝子変異神経の解析。Dreamless変異によるNALCN機能の変化を検討するために、野生型およびDreamless変異型のNALCNをHEK293細胞に発現させ、パッチクランプ法による電気生理学的な解析を行った。変異型NALCNは野生型に比べて顕著にイオン透過性が高まっていた。イオン選択性に乏しい点や膜電位非依存性である点については、野生型と同様であった。Dreamless変異マウス脳におけるレム睡眠制御神経の活動変化を明らかにすることが必須である。レム睡眠を抑制することが知られている中脳網様体のdeep mesencephalic nucleusをスライスパッチ法にて解析した。野生型に比べて、Dreamless変異マウスは記録中の平均膜電位が高く、発火頻度も高かった。レム睡眠エピソードの終止に関わる神経細胞群が過剰に活動するために、レム睡眠エピソードが短縮し、ひいては全レム睡眠時間が減少することを示唆している。